Leta i den här bloggen

torsdag 12 april 2018

TRIM5alfa (Kr.11p15.4), RNF(88), (C.IV, SPRY). Antiretroviraali restriktiotekijä


TRIM 5 sijaitsee kromosomissa 11 geeniklusterissa monien TRIM-geenien kanssa. Sillä on myös nimi RNF88 ja TRIM5alfa. Se kuuluu rakenteellisesti C_IV alaryhmään: N-terminaalissa on RING, Bbox 2 ja coiled coil,  helikaalinen alue.  C-terminaalissa on  B30.2 SPRY. Proteiini muodostaa homo-oligomeerejä helikaalisen domeeninsa avulla ja sijoittautuu sytoplasmisiin kappaleisiin, täpliin. Se ubikitinoituu itse säädellen subsellulaarista sijoittautumistaan ja toimii  E3 ubikitiiniligaasina  Sillä saattaa olla osuutta retrovirusrestriktiossa, vaikka on tietoa että se kyllä kiinnittyy HIV-1  viruskapsidiin mutta sen restriktio ei ole riittävää. TRIM5alfa omaa useita alternatiivisesti pleissautuneita variantteja ja ne koodaavat erilaisia isoformeja. niistä vain  yksi on antiretroviraali, tämä TRIM5alfa.  TRIM5 ilmenee virtsakossa, endometriumissa ja 25 muussa kudoksessa.
  • Also known as RNF88; TRIM5alphq
  •  Summary.The protein encoded by this gene is a member of the tripartite motif (TRIM) family. The TRIM motif includes three zinc-binding domains, a RING, a B-box type 1 and a B-box type 2, and a coiled-coil region. The protein forms homo-oligomers via the coilel-coil region and localizes to cytoplasmic bodies. It appears to function as a E3 ubiquitin-ligase and ubiqutinates itself to regulate its subcellular localization. It may play a role in retroviral restriction. Multiple alternatively spliced transcript variants encoding diffrent isoforms have been described for this gene. [provided by RefSeq, Dec 2009] Expression Ubiquitous expression in urinary bladder (RPKM 5.4), endometrium (RPKM 5.4) and 25 other tissues See more

Mitä uutta tästä geenistä tiedetään? (Suurin osa tiedosta koskee sen toimintaa antiretroviraalisessa funktiossa. Kuten tiedetään antiretroviraalinen immuunipuolustus on ihmisellä hyvin heikko eläimiin verrattuna  ja HIV-1 esim. jatkaa pandemista kulkuaan maasta toiseen eikä ihmisgenomi pysty poistamaan sen provirusta toistaiseksi, nykyisillä antiviraalisilla rahkeilla. Terveistä ja parantuneista retroviruksen saaneista ei ole tietoa.  Tietääkseni. Ja jos heitä on, millä mekanismilla keho olisi voittanut genomiin pesiytyeen (osittain) pandemisen  proviruksen siinä tapauksessa - ja mekanismi olisi jällen jokin “novel”, uusi löytö. Kuten tiedetään, DNA:n korjausjärjestelmä ei tunnista mutaatiota vieraaksi eikä korjaa sitä, mutta provirus sen sijaan ei ole mutaatio toistaiseksi, joten saattaa olla jokin vieraantunnistus järjestelmä mahdollinen.
 Näyttää etsityn toisenlaistakin strategiaa. Koska TRIM5 on antiretroviraali ainakin joissain retrovirusluokissa, voidaan tarkentaa, täsmentää ja vahvistaa sen kykyä myös rajoittaa HIV-1 virus. Tällä kertaa suomennan vain tätä asiaa käsittelevää artikkelia 1.

Related articles in PubMed

  • I Tyypin interferonin indusoima restriktiofaktori TRIM5alfa pystyy estämään ihmissolujen infektoitumisen eräillä ei-ihmisperäisillä retroviruksilla (N-MLV ja EIAV), mutta ei pysty kohdentamaan riittävää restriktiota HIV-1 virukseen. Mutta jos johdetaan ihmisen Trim5alfaan kaksi aminohapposubstituutiota (R322G ja R355G) siihen domeeniin, joka tunnistaa retroviruskapsidia, saadaan stabiililla yliexpressiolla aikaan tehokkaampaa HIV-1 restriktiota. Tarkasti geenimuovaamalla DNA (CRISPR-Cas9- perusteisella mentelmällä) voitaisiin modifioida TRIM5 ihmissoluissa. CRISPR tulee sanoista Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ja Cas9 lyhennys tarkoittaa : CRISPR-associated protein 9. Siis tässä menetelmässä tehdään DNA:n kummankin kromatidisäikeen katkemakohta (DSB) ja sitten johdetaan rakenteen kahteen arginiinikohtaan glysiini. DNA korjaa itsensä sopeuttaen tämän mutaation.
      (Suomesnosta: Johdanto)
    • Introduction
Virukset ovat obligatorisia parasiittejä, jonka onnistunut isäntäsolun infektoiminen vaatii antivirustekijöiden evaasion. Imettäväisistä on tunnistettu monia solun antivirustekijöitä, jotka mahdollisesti interferoivat virusinfektion progredioitumisen myötä. Nämä faktorit voivat joskus toimia ilman ulkoosta stimulusta, mutta niiden ilmenemä ja aktiivisuus lisääntyy interferoni-I:n vaikutuksesta. Retrovirusten (kuten HIV-1) suhteen relevantteja interferonilla stimuloituvia geenejä (IGS) on muun muassa TRIM5alfa. Se koodaa sytoplasmista proteiinia TRIM5alfa. Ihmisellä geenistä koodautuu viisi eri isoformia, joista vain tämä TRIM5alfa on antiviraali vaikutukseltaan. Retrovirukseen kohdentuvan spesifisyyden määrää proteiinin C-terminaali , domeeni SPRY (PRYSPRY, B30.2) . Tässä domeenissa on hypervariabeleita silmukoita, jotka tekevät heti interaktion viruskapsidiproteiinin N-terminaalin kanssa, kun retrovirus on tullut isäntäsolun solukalvoon. Kun sellaista interaktiota tapahtuu, retrovirus kohtaa restriktiota esim. inhibitiota sellaisen mekanismin kautta, joka destabilisoi, epävakauttaa sen kapsidiytimen tai passittaa proteosomisilppuriin osia sen ydinkomponenteista tai viruspartikkeleita saostuu TRIM5alfan sytoplasmisiin kappaleisiin. Ihmisen TIM5alfa ei omaa aktiivisuutta HIV-1 virusta vastaan, korkeintaan hieman , sensijaan se vaikuttaa tehokkaasti estäen infektiivisyyttä N-MLV- viruksesta ( non human gammaretrovirus, N-trooppinen hiiren leukemia virus, N-MLV) ja EIAV-viruksesta (hevosen infektioanemiavirus, lentivirus). Endogeeninen ihmisen TRIM5alfa estää mainittua kahta retrovirusta 100-kertaisesti ja vastaavasti 10-kertaisesti .

  • Viruses are obligate parasites whose success at infecting a host cell typically requires evasion from antiviral factors. In mammals, many cellular antiviral factors that can potentially interfere with the progression of viral infections have been identified. These factors can often act without external stimulation, but their expression and activity are enhanced by type I interferons (IFN-I) [1]. Among the IFN-stimulated genes (ISGs) relevant to retroviruses, the family of viruses to which HIV-1 belongs, is TRIM5, which encodes the cytoplasmic protein TRIM5α [2]. In humans, TRIM5 is transcribed into 5 isoforms, among which only TRIM5α possesses antiviral activity [3]. At its C-terminus, a domain called SPRY (PRYSPRY, B30.2) determines the retrovirus targeting specificity. This domain comprises hyper-variable loops that directly interact with the N-terminal domain of capsid proteins early after entry of the retrovirus into the host cell membrane [4]. When such interactions occurs, the retrovirus is inhibited (“restricted”) through mechanisms that include destabilization of the capsid core [5], proteasomal degradation of some core components [6] and sequestration of the viral particle in TRIM5α cytoplasmic bodies [7]. huTRIM5α generally has little-to-no activity against HIV-1, but efficiently inhibits the infectivity of the nonhuman gammaretrovirus “N-tropic” murine leukemia virus (N-MLV) as well as the nonhuman lentivirus equine infectious anemia virus (EIAV) [8]. Those two viruses are typically inhibited ~10-fold (EIAV) and ~100-fold (N-MLV) by endogenous huTRIM5α, with some variation depending on the cellular context.

Monet ryhmät ovat koettaneet vahvistaa TRIM5alfan antiviruskykyjä, jotta saa sen ehkäisemään HIV-1 virusta. Tätä virusta rajoittaa tehokkaasti ( 100 kertaisesti) eräät TRIM5alfa-ortologit, joita on löydetty vanhan maailman apinoista kuten Rhesus macaquen TRIM5alfa (rhTRIM5alfa). Kuitenkin merkitsevät sekvenssivariaatiot ihmisen ja macaque-ortologin välillä sulkevat jo edeltä pois mahdollisuuden käyttää jälkimmäistä sekvenssiä geeniterapiaan perustuvassa lähestymistavassa, koska se lisäisi potilaissa riskiä transgeeniin kohdistuvaan immuunivasteeseen. Niinpä kaikki tutkimukset ovat käsittäneet ihmisen TRIM5alfan yliexpressioversioita, joissa on hahmoteltu SPRY-domaanimodifikaatioilla HIV-1 virukseen kohdentamisia. Jotkut käytetyt TRIM5alfa variantit ovat olleet kimeerisiä tuotteita, jotka ovat sisältäneet pieniä alueita rhTRIM5alfasta SPRY-domeenissa. Eräät tutkijaryhmät selvittivät tarkemmin, mikä determinanttien ero oli rhTRIM5alfan ja huTRIM5alfan kesken HIV-1 restriktiodomeenissa. Havaittiin, että mutatoimalla Arg332 ihmisen TRIM5alfassa saatiin jo riittävä HIV-1 restriktio aikaan. Aluksi oltiin siinä toivossa, että yksittäinen mutaatio tähän asemaan inhiboisi HIV-1:tä yhtä tehokkaasti kuin rhTRIM5alfa, mutta niin ei kuitenkaan ollut.
  • Several groups, including ours, have attempted to harness the antiviral power of TRIM5α in order to interfere with HIV-1. This virus is efficiently restricted (~100-fold) by some orthologs of TRIM5α found in Old World monkeys such as the Rhesus macaque TRIM5α (rhTRIM5α) [2]. However, significant sequence variation between the human and macaque orthologs preclude the possibility of using the latter one in gene therapy approaches, as this would increase the risk to elicit an immune response against the transgene in patients. Thus, all the studies have consisted in over-expressing versions of huTRIM5α designed to target HIV-1 through modifications in the SPRY domain. Some of the TRIM5α variants used were chimeric products containing small regions of rhTRIM5α in the SPRY [9, 10]. Other teams mapped with further precision the HIV-1 restriction determinants in rhTRIM5α that were absent in huTRIM5α, leading to the discovery that mutating the Arg332 residue in huTRIM5α was sufficient to inhibit HIV-1. Although initial observations [11, 12] raised the hope that single mutations at this position might inhibit HIV-1 as efficiently as rhTRIM5α did, later work made it clear that this was not the case [13].
Tutkijat jatkoivat toisella lähestymistavalla. He tekivät kirjastot TRIM5alfa SPRYmutanteista ja sitten tekivät toiminnallisen seulonnan isoloiden ne mutantit, joilla oli HIV-restriktiovaikutusta. Näissä tutkimuksissa tunnistettiin arginiini332 (R332) kohdan estävän HIV-1:tä 5-10-kertaisesti. Kun he yhdistivät molemmat mutaatiot Arg335 (R335G) ja Arg332(R332G), he saivat restriktiotasoja, jotka olivat korkeammat kuin kummankaan yksittäisen mutantin. Vaikka R332G-R335G huTRIM5alfa ei ollut yhtä restriktiivinen kuin rhTRIM5alfa, niin kuitenkin se esti tehokkaasti hyvin patogeenisen HIV-1 kannan propagoitumisen, ja transgeenisillä soluilla ilmeni elossapysymisetuja enemmän kuin modifioimattomilla soluilla.

  • Our laboratory explored a different approach: generating libraries of TRIM5α SPRY mutants then applying a functional screen to isolate mutants that conferred HIV-1 restriction [14, 15]. These studies identified mutations at Arg335 inhibiting HIV-1 by 5- to 10-fold. When we combined a mutation at Arg335 (R335G) with one at Arg332 (R332G), we obtained restriction levels that were higher than with either of the single mutants [14, 15]. Although not quite as restrictive as rhTRIM5α, R332G-R335G huTRIM5α efficiently inhibited the propagation of a highly pathogenic strain of HIV-1, and cells expressing the transgene had a survival advantage over unmodified cells [13].
    Vaikka HIV-1 geeniterapiassa pidetään R332G-R335G huTRIM5alfaa primäärikandidaattina estämään HIV-1 virusta käyttämällä virusvektoreita yli-ilmentämään sitä ihmissoluissa, on asiassa kuitenkin ongelmiansa. Todellakaan ei vielä tiedetä, mitä TRIM5alfan yliexpressoiminen tulisi merkitsemään ihmissoluissa ottaen huomioon, että kyse sen funktioissa on luonnollisista immuunivasteista ja mahdollisesta autofagiasta. Lisäksi lentivirusvektoreiden genotoxisuus ihmisgenomiin integroituna ei ole vielä tarpeeksi ennustettavissa. Pitemmän päälle olisi suositeltavampaa kyetä johtamaan ihmisen endogeeniseen TRIM5:een mutaatioita geenimuovauksella. Kaikein edistynein lähestymistapa mutaatioiden johtamiseen käsittää DSB – induktion ( DNA:n katkaisun) käyttämällä klusteroituja säännölliset välimatkat omaavia lyhyitä palindroomisia toistoja ( CRISPR) ja niihin assosioituvaa proteiinia Cas9 ja samalla tarjottuna “donoriDNA” templaatiksi HDR-korjausjärjestelmälle ( omology Directed Repair of DNA).
  • Although R332G-R335G huTRIM5α is considered a prime candidate in HIV-1 gene therapy approaches to inhibit HIV-1 [13], using viral vectors to overexpress it in human cells is not without caveats. Indeed, the physiological effects of TRIM5α overexpression in vivo are not clear, considering that it is involved in innate immune responses [16, 17] and possibly in autophagy [18]. In addition, the genotoxicity of lentiviral vectors integrating in the human genome is still poorly predictable. In the longer term, it would thus be desirable to be able to introduce mutations in the endogenous human TRIM5 by genome editing. The most advanced approach toward this aim consists in inducing double strand DNA breaks through the use of the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) with CRISPR-associated protein 9 (CRISPR-Cas9) system, and simultaneously providing a single-stranded “donor DNA” to serve as a template for homology-directed repair (HDR)
Tässä raportissa tutkijat käyttivät yksinkertaista DNA-transfektioon perustuvaa protokollaa eri komponentien introdusoimiseksi transfektio-permissiivisiin ihmissolulinjoihin. He mutatoivat onnistuneesti Arg332 ja Arg335 näissä soluissa, vaikka epätoivottujakin mutaatioita ilmeni ja sellaisia kloonattuja soluja ei ollut, joissa kaikki TRIM5 alleelit olisivat kantaneet korjauksia.

  • [19, 20]. In this report, we use a simple, DNA transfection-based protocol to introduce the various components required into a highly transfection-permissive human cell line, HEK293T. We successfully mutate Arg332 and Arg335 of TRIM5 in these cells, although undesired mutations are also found and no cell clone could be isolated that had all TRIM5 alleles bearing the corrections.
IFN-I:llä (interferonilla) indusoituva ihmisen restriktiofaktori TRIM5alfa estää ihmissolujen infektoitumisen ei-ihmisperäisillä retroviruksilla (N-MLV ja EIAV) , mutta yleensä se ei kohdenna HIV-1 virukseen. Mutta jos ihmisen TRIM5alfaan, sen retroviruksen viruskapsidia tunnistavaan domeeniin, johdetaan kaksi aminohapposubstituutiota R332G ja R335G ja sitä stabiilisti yliekspressoidaan, seuraa tehokasta HIV-1 viruksen restriktiota. Voidaan käyttää CRISPR-Cas9-perusteista lähestymistapaa DNA:n täsmämuovaukseen modifioimaan ihmissolujen TRIM5. Tutkijat käyttivät tätä mentelmää onnistuneesti mutatoiden TRIM5:n mahdolliseen HIV-1 virusrestriktiiviseen versioon HDR-korjauksessa solussa. Tutkimus demonstroi toteutettavissa olevan TRIM5geenin muovauksen ihmissoluissa ja tunnistaa päähaasteita , jotka pitää ottaa huomioon, jos tätä lähestymistapaa käytetään HIV-1 virukselta suojautumiseen.

  • The type I interferon (IFN-I)-inducible human restriction factor TRIM5α inhibits the infection of human cells by specific nonhuman retroviruses, such as N-MLV and EIAV, but does not generally target HIV-1. However, the introduction of two aminoacid substitutions, R332G and R355G, in the human TRIM5α (huTRIM5α) domain responsible for retroviral capsid recognition leads to efficient HIV-1 restriction upon stable over-expression. CRISPR-Cas-based approaches to precisely edit DNA could be employed to modify TRIM5 in human cells. Toward this aim, we used a DNA transfection-based CRISPR-Cas9 genome editing protocol to successfully mutate TRIM5 to its potentially HIV-1-restrictive version by homology-directed repair (HDR) in HEK293T cells. Nine clones bearing at least one HDR-edited TRIM5 allele containing both mutations were isolated (5.6% overall efficiency), whereas another one contained only the R332G mutation. Of concern, several of these HDR-edited clones contained on-target undesired mutations, and none had all the alleles corrected. Our study demonstrates the feasibility of editing the TRIM5 gene in human cells and identifies the main challenges to be addressed in order to use this approach to confer protection from HIV-1.
  3. TRIM5 gene polymorphisms in HIV-1-infected patients and healthy controls from Northeastern Brazil. Celerino da Silva R, et al. Immunol Res, 2016 Dec. PMID 27388872
GENERIF lähteen yhteenvetoja. GeneRIFs: Gene References Into FunctionsWhat's a GeneRIF?



Muistiin 12.4. 2018



Upplagd av kl.
Etiketter: , , , ,

Inga kommentarer:

Skicka en kommentar

Prenumerera på: Kommentarer till inlägget (Atom)