Kemian Nobel. Taustasta (2) . Fotolyaasi (Sancar) . Fotoreaktivaatio,ensimmäinen DNA:n korjausmekanismi. NER

http://www.kva.se/globalassets/priser/nobel/2015/kemi/sciback_ke_en_15.pdf
Tieteellinen tausta   tämän vuoden  Kemian Nobelin palkinnolle:   DNA: n korjautumisen mekanistisista tutkimuksista on tehty tietue Ruotsin Kuninkaallisen Tieteellisen Akatemian   Kemian luokan avulla 7. 10. 2015.
TAUSTASTA ( 2)

  Fotoreaktivaatio- ensimmäinen DNA:n korjautumismekanismi

• Aikoinaan 1920-luvulla havaitsi amerikkalainen geneetikko Herman Muller (1946 Fysiologian Nobelin palkinto), että röntgensäteet pystyivät tekemään mutaation soluihin ja tappamaan niitä Sen jälkeen osoitettiin, että muun kaltaisetkin agenssit, niitten joukossa UV-säteily, saattoivat vaikuttaa solun elinkykyisyyteen ja mutaatiopitoisuuteen. Siihen aikaan ei tunnettu, mikä oli se solukohde, johon röntgensäteet ja UV-valo pystyivät niin kuolettavasti vaikuttamaan. Ei tunnistettu niitä mekanismejakaan, jotka pystyisivät korjaamaan jo ilmentyneitä vaurioita.
• 1940-luvun lopulla tapahtui nopea edistyminen , kun Albert Kelner oli bakteeritutkimuksissaan havainnut bakteerien pystyvän toipumaan UV-valon aiheuttamista vaurioista. Kelner havaitsi, että näkyvä valo saattaisi todella tuntuvasti stimuloida kasvun toipumista siitä kasvun jarruttumasta, jonka UV-altistus oli aiheuttanut. Tätä ilmiötä alettiin kutsua fotoreaktivaatioksi ja löytö viittasi sellaisten valosta riippuvaisten solumekanismien olevan olemassa , jotka kykenivät korjaamaan UV-säteilyn aiheuttaman soluvaurion.

• Vuonna 1944 Oswald Avery et al. olivat osoittaneet DNA:n olevan ainesta, joka ihmisessä vastasi perinnöllisyydestä (herediteetti).
• 1950-luvulla tuli selväksi, että todennäköisimmin juuri DNA oli kohde UV- valon aiheuttamissa vaurioissa. Siinä vaiheessa Renato Dulbecco ( 1975 Nobelin palkinto fyiologiassa/lääketieteessä) oli sitä mieltä, että fotoreaktivaatio oli näkyvästä valosta riippuvainen entsymaattinen reaktio. Tämän oletuksen oikeus osoitettiin Stanley Rupertin toimesta: raporttisarjallaan hän osoitti, että DNA voi reaktivoitua näkyvästä valosta soluttomassa miljöössä E-coli tai S. cerevisiae- uutteessa Tämän entsymaattisen aktiviisuuden , fotolyaasin, observointi olikin erittäin olennainen havainto, koska ensimmäistä kertaa voitiin osoittaa sellaisen DNA:ta korjaavan entsyymin olemassaolo, mikä pystyi korjaamaan UV-säteilytettyä DNA: ta.
• Aluksi fotolyaasi tarkoitti vain uutteessa olevaa aktiivisuutta, mutta vuonna 1978 Aziz Sancar pystyi kloonaamaan E.Coli bakteerista fotolyaasin geenin ja runsauttamaan geenituotetta in vivo. Siihen aikaan Sancar toimi PhD opiskelijana Rupertsin instituutissa. Mutta sen sijaan että olisi jatkanut fotolyaasin karakterisoimista, hän teki PhD väitöstyönsä ja valmistui. Kului toiset kuusi vuotta, ennekuin Sancar palasi tutkimaan fotolyaasia. 
  
  
  

  Entsyymi  fotolyaasi ja sen reaktiomekanismi 

  
  

  Vuonna 1982 Aziz Sancar alkoi toimia Pohjois Karolinan Yliopiston tiedekunnassa ja samalla hän palasi PhD projektinsa aihepiiriin, fotolyaasiin. Vuosina 1964 - 1989 Sancar julkaisi i sarjan töitä, joissa hän kuvasi fotolyaasifunktion mekanismeja. Hän tunnisti myös kaksi kromoforia E.Colin entsyymistä. Sancar osoitti, että fotolyaasi pystyy konvertoimaan kemialliseen muotoon absorboituneen fotonin energian. Jolloin syntyy paikallinen vapaa radikaali, joka aloittaa tymniinidimeerin (TT) pilkkomisen erilleen toisistaan

  
  

  Toinen kahdesta Sancarin fotolyaasissa identifioimasta kromoforista on täysin redusoitunut flaviini-adeniini-dinukleotidia (FADH). Tämä kromofori toimii katalyyttisenä kofaktorina ja excitaatiossa ( viritystilassa). Varsinaisen korjauksen vaikuttaa virittyneen flaviinikofaktorin elektronin siirtymä pyrimiriinidimeeriin ( esim TT, jossa  tymiinit ovat kovalenttiseti kiinni toisissaan, jolloin  ne eivät kelpaa DNA-aineeksi) )- ja elektronin siirtymästä  seuraa  varauksella toisistaan  erotettu radikaalipari, kaksi tymiiniä  (FADH + pyrimidiini<> pyrimidiini -). Dimeerin anioninen rengas pilkkoutuu sykloriversiolla ja liikaelektroni palaa flaviiniradikaaliin palauttaen sen katalyyttisesti pätevän muodon FADH ja päättää täten katalyyttisen fotosyklin. (Kuva 2).

  
  

  Tämä reaktio on valon aktivoima, koska flaviinikofaktori saattaa virittyä suoraan fotonin absorptiosta tai resonansienergiasta, jota siirtyy toiselta kromoforilta, tuntopigmentiltä (met-TH4 tai deazaflaviini) , joka kokoaa auringonvaloa ja vahvistaa DNA:n korjaustehokkuutta. 
  
  

   NER korjausjärjeselmä nisäkäskehossa

  
   Fotoreaktivaatio oli ensimmänen tunnistettu DNA:n korjausmuoto, mutta tämä prosessi ei ole nisäkäskehossa konservoitunut, vaan niissä NER- korjausjärjestelmä toimii UV-säteilyvaurion korjaajana. Kuitenkin fotolyaasilla on nisäkkässä homologinsa, ja niillä on käyttöä kirkadisen kellon asentamisessa, esim. valolle vastaavien biologisten prosessien säätelyssä.

  
  (Kuva 1. osoittaa yksinkertaistettuna miten E. Coli-bakteerissa voi tapahtua korjaus leikkaamalla nukleotidi pois: ( NER, nukleotidi excision repair) Ensin heterotrimeerit UvrA ja UvrB asettuvat DNA-vauriokohtaan. Sitten DNA sykertyy ja osittain UvrB:n avulla oikenee ATP.stä riippuvassa reaktiossa. UvrA erkanee ja UvrC sitoutuu UvrB:n ja DNA:n muodostamaan kompleksiin, mikä aktivoi UvrB:n tekemään katkaisun 3´päästä ja sen jälkeen seuraa UvrC.stä riippuva katkaisu 5´päästä. Irtileikattu oligomeeri vapautuu UvD-helikaasilla. Polymeraasi Pol 1 täyttää syntyneen aukkokohdan ja samalla myös vapauttaa UvrB:n. Lopuksi korjauspala kiinnitetään ligaasilla paikoilleen.)
  
  KTS: Aziz Sancar:
   http://www.med.unc.edu/biochem/people/faculty/primary/asancar

DNA:n korjausmekanismien (BER, NER, MMR) löytämisestä palkitut T Lindal, A Sancar ja P Modrich

 https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2015/advanced-chemistryprize2015.pdf

The Nobel Prize and Mechanistic DNA Repair

Tomas Lindahl, Paul Modrich, and Aziz Sancar are sharing this year’s prize in chemistry.

• Oct 7, 2015

This year’s Nobel Prize in Chemistry has been awarded jointly to Tomas Lindahl, Paul Modrich, and Aziz Sancar for their work on the mechanistic studies of DNA repair.

Their worked mapped at a molecular level how cells repair damaged DNA and protect genetic information.

“Their work has provided fundamental knowledge of how a living cell functions and is, for instance, used for the development of new cancer treatments,” the Nobel committee said in a statement.

• Tomas Lindahl, 

 of the Francis Crick Institute and Clare Hall Laboratory, in Hertfordshire, showed the rate at which DNA decayed should have made life on Earth impossible. His work led him to base excision repair (BER), a molecular machinery that constantly counteracts our DNA’s collapse.

• Aziz Sancar, 

 of the University of North Carolina, Chapel Hill, mapped nucleotide excision repair (NER), which cells use to repair damage to DNA by UV radiation.  An improperly functioning repair mechanism can lead to skin cancer.

• Paul Modrich, 

of the Howard Hughes Medical Institute and Duke University School of Medicine, in Durham, North Carolina, showed how mismatch repair (MMR)  works. Mismatch repair is the mechanism by which cells correct errors that occur when DNA is replicated during cell division—reducing the error frequency by about a thousandfold. Congenital defects in mismatch repair can cause a hereditary variant of colon cancer.

• SOLUNETTI sitaatti: 

DNA:n korjausmekanismit

Muista makromolekyyleistä poiketen DNA-molekyyleillä on omat korjausmekanisminsa. DNA.n korjaus on solujen toiminnalle tärkeää ja korjaamattomat vauriot voivat aiheuttaa mm. syövän. Kaikilla soluilla onkin useita korjausmekanismeja. DNA:n korjauksen tärkeyttä kuvaa myös se, että kun muissa metabolisissa reaktioissa käytetään mahdollisimman pieniä, tilanteeseen optimoituja määriä energiaa (ATP:tä), DNA:n korjaukseen käytetään varsin runsaasti ATP:tä.

• Oikolukukorjaus replikaation aikana

Jo DNA:n polymerisaation eli replikaation yhteydessä toimiva DNA-polymeraasi oikolukee tuottamaansa DNA:ta eli poistaa lisäämänsä väärät nukleotidit (nk. 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuus).

•  Replikaation jälkeinen korjaus

 Jos DNA:han kuitenkin jää virheitä replikaation jälkeen, ne korjataan nopeasti. DNA on solussa normaalisti metyloituna ja vain hetken replikaation jälkeen uusi juoste on metyloimaton. Tämän perusteella solu voi erottaa uuden ja vanhan juosteen ja korjata väärin pariutuneet emäsparit vanhan juosteen sekvenssin mukaisiksi. 
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/95/Nucleotides_1_FR.svg/1320px-Nucleotides_1_FR.svg.png
DNA:n nukleotidien emäkset (adeniini, tymiini, sytosiini,  guaniini)
 voivat vaurioitua, esimerkkinä sytosiinin deaminaation (typpiryhmä poistuu) seurauksena syntyvä urasiili (normaalisti vain RNA:ssa esiintyvä emäs). Tällaisia vaurioituneita emäksiä poistavat DNA:sta omat entsyyminsä (DNA-glykosylaasit). 

(Kommentti:  Emäkset  adeniini ja guaniini omaavat PURIINI-rakenteen.
Emäkset tymiini, sytosiini ja urasiili omavat PYRIMIDIINI-rakenteen.
Emäs liittyy riboosisokeriin  ennen kuin siitä voi tulla geneetisen amteriaalin jäsen.
emäs + sokeri saa toisen nimen vastaavasti (nukleosidi ):
Adenosiini, Tymidiini, Sytidiini, Guanidiini, Uridiini
DNA:ssa oleva sokeri on desoxy--muodossa (d) . Siitä muodosta voi glykosylaasi irrottaa  emäsosan.
Mutta nämä sokeriset emäkset ovat DNA:ssa  fosforyloituja. Jotta ne voivat rakentua DNA-runkoon ne tehdään ensin fosfaateikseen adenosyyli-, tymidyyli-,, sytidyyli- guanidyyli- uridyyli- fosfaateiksi:  nukleotidifosfaateiksi (NTP, NDP, NMP)
Nukleosidi joka on ottanut fosfaatin muuttaa nimensä nukleotidiksi (nt) ja fosfaatit ovat nukleotidimonofosfaatti, nukleotididifosfaatti, nukleotiditrifosfaatti. 
Kun nukleotiditrifosfaatti tai difosfaatti (NTP) (NDP)  liitetään replikaatiossa  liittämisessä irtoutuu fosfaattia  fosfaattia  ja yksi  P-ryhmä jää. tukirunkoon.  Genomin ylläpito vaatii luonnollisesti paljon energiaa ja sitä varten ihminen tarvitsee RUOKAA  joka on se ihmisen  ENERGIA, joka muutetaan  DNA:n tarvitsemaan muotoon.
Energisin muoto  näitä rakennusmolekyylejä  on energiapakkaukset  ATP,  TTP, CTP, GTP, UTP.
 Jos  sokeri on  desoxy- muodossa voidaan kirjoittaa dATP, dTTP, dCTP, dUTP.
Vastaavasti kahden fosfaatin  muoto on ADP, TDP, CDP, GDP, UDP ja  d- muodot dADP, dTDP, dCDP, dGDP. dUDP) Yhden fosfaatin muodot ovat AMP, TMP, CMP, UMP ja d- muodot dAMP, dTMP, dCMP, dGMP, dUMP.
Pelkkä  fosfaatiton  ja sokeriton  muoto (emäs, base)  merkataan isolla kirjaimella   A, T, C, G, U.
  Puriinit ovat A  ja G, pyrimidiinit ovat T, C ja U.
Molekulaarisesti  parhaiten  sopivat Watson Crick - emäsparit (puriini-pyrimidiini-pari) (bp, base pair)  kuten A-T ja G-C, ja  silloin  DNA- kaksoishelix on  struktuuriltaan ja stabiliteetiltaan- kuten myös   normaalilta ihmeellisesltä fysiologiselta käyttökykyisyydeltään  ideaalisin.)

 (Alla olevassa kuvassa on pariutumaton DNA juoste. ssDNA, joka ei todellakaan ole niin stabiiliraeknne kuin kaksoisjuoste, josas on niitä Watson Crick- parejaa. Tämä yksinekertainen  perustuu fosfaatisiltoihin sokereiten välillä.  Tosin  vierekkäisten emäisten kesekn lie jotain säännönmukaisuutta  olemassa.


"Poistetun emäksen kohdalle tehdään myös sokerifosfaattirankaan katkos (endonukleaasi-entsyymi). Joissakin tapauksissa vaurioituneet nukleotidit poistetaan suoraan kokonaan (ei emästä erikseen, eksinukleaasi-entsyymi). Emäksen/nukleotidin poistamisen jälkeen DNA-polymeraasi ja ligaasi korjaavat vauriokohdan. Lisäksi joitakin emäsvaurioita voidaan korjata katkaisematta juostetta. Esimerkkinä O⁶-metyyliguaniinin korjaaminen, missä ylimääräisen metyyliryhmän poistamiseen kulutetaan yksi metyylitransferaasiproteiini jokaista vauriota kohti.

Replikaation aikana kohdattavat vauriot voidaan E. colissa korjata kahdella eri tavalla. Normaalisti DNA-polymeraasi III ei voi kahdentaa virhekohtaa, vaan hyppää sen yli ja jatkaa replikaatiota vähän matkan päästä. Replikaation jälkeen tämä kohta korjataan rekombinaation avulla. Jos vaurioita on paljon, normaali replikaatio pysähtyy. Tällaisessa stressitilanteessa replikaatiota hoitavat entsyymit, joiden kanssa DNA-polymeraasi III voi kahdentaa myös vaurioituneita kohtia, mutta samalla syntyy mutaatioita. Stressitilanteen replikaatio johtaakin usein solun kuolemaan. 

Vertaa kaksoishelix ja sen mahdollisuus olla stabiili: