Poikkeuksellinen sykliinistä riippuva kinaasi Cdk8 . Tärkeä solun Gap 0 vaiheen kohdalla

LÄHDE: BANYI Gabor. The CDK module. In: Mediator and cell cycle regulation. p. 15-17. 

Institute of Biomedicin at Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg.

Väitöstilaisuus oli 20.11. 2015 Akatemiassa

ISBN978-91-9561

CDK 8 moduli ja Cdk8 , sykliinistä riippuva kinaasi 8

Sitten seuraavaksi katson tietoja kinaasista Cdk8. Sekin nimittäin on sitä laatua kinaasi, jota en oppinut tuntemaan solusyklin peruskuviota selittävissä väitöskirjoissa, joista olen tietoa hankkinut- johtuen siitä että G0 vaiheesta G1 vaiheeseen tapahtuva siirtymä tai G0 vaiheessa pysymä /differentiaatiosuunta  ei ollut ensimmåinen asia, mitä solusyklistä saatiin selville.

Tästä kinaasista löydän Wikipedian lisäksi syventävän tiedon Gabor Banyain väitöskirjasta . Tämä sykliini omaa erityisiä poikkeuspiirteitä ja loppujen lopuksi sen funktiotapa ei ole niin yksinkertainen etteikö olisikin aihetta sanoa CDK 8 moduli. Cdk8 on mielenkiintoinen ja eräänlainen funktionaalisen verkoston yksi keskipisteessä oleva tekijä, se toimii solusyklissä pisteessä, jossa jenkoilta luistaminen on käytännössä tavallista. Vaikka ihmiskunnan normaalikasvu miljoonavuosiperspektiivillä on jenkoillaan, siis normaali on tavallisisnta universumissa,ja  siirtyy sukupolvesta toiseen elinkelpoisena.   Tarkoitan tässä, että modulilla ja sen alayksiköllåä on kyllä  onkogeenistä potentiaalia. Kuitenkin kaikitenkin  vähemmistöllä maailmassa on syöpä. Korjausmekanismejakin on aika joukko. Korjaantuvuus lie genomissakin  valmiina, kun sille annetaan edellytyksensä ( jotka vain töytyy löytää).  Kuten haavat paranevat kun tulehdus poistetaan.

Nyt käännän suoraan väitöskirjan johdantotekstiä:

Sivulta 15. kappale 1.3.2. The CDK 8 module

CDK 8 moduliin kuuluu neljä proteiinia ja ne ovat edellä mainittu CycC, Cdk8, Med112 ja Med13 (L-Mediator sisältää nämä molemmat Med-ryhmät, Large Mediator) .

Varhaiset geneettiset ja biokemialliset seulonnat ovat viitanneet siihen, että CDK8 moduli on transkription säädössä negatiivisesti säätelevässä osassa ja se pystyy vaimentamaan Pol II aktiivisuutta ( Polymeraasi II) .

Kinaasiosatekijä on Cdk8 ja se pystyy fosforyloimaan polymeraasi II:n C-terminaalisen domeenin (CTD) ennenkuin PIC muodostuu ( Pre-Initiation Complex) ja tällä tavalla transkriptio estyy (Hengartner et al. 1998).

Toiset tutkijat taas ovat osoittaneet, että Cdk8 voi fosforyloida (PIC-kuuluvan) TFIIH tekijän ja tällä tavalla estää Cdk7:n aktiivisuuden.

Täten välillisestikin Cdk8 estää polymeraasin C-terminaalisen domeenin fosforylaatioon ja tapahtuu promoottorin välttö (promotor escape) (negatiivinen vaikutus transkription aloittamiseen) (Akoulitchev et al. 2000).

Myöhemmät tutkimukset ovat osoittaneet, että Cdk7:n poissaollessa, Cdk8 saattaa omata myös positiivista vaikutusta transkriptioon. Tästä voidaan käsittä,, että CDK8-moduli on paljon monimutkaisempi prosessi, mitä aluksi oltiin oletettu (Liu et al. 2004)

Jos CDK8 modulia kohtaa jokin mutaatio, seikka assosioituu erilaisiin syöpämuotoihin.

Se TF (Transcription Factor), mikä tässä yhteydessä mainitaan on avainasemassa: . TF -tekijöitä on monta ja transkription alkamisen (initiation) viime vaiheessa rekrytoituu tämä multimeerinen proteiini pre-initiaatio-kompleksiin (PIC) Tässä TFIIH multimeerissä on osana Cdk7, joka aktiivina pystyy fosforyloimaan joka viidennen seriiniaminohapon C-terminaalisissa heptadeissa katalysoiden täten sitä vaihdetta, joka sijaitsee PIC-muodostuksen ja aktiivin pidentymisen välillä (Buratowski, 2009)

Sitten väitöskirjqassaq kuvataan CDK8 modulin kinaasi-alayksikköä Cdk8 tarkemmin kappaleessa 1.3.2.1. sivuilla 15- 17. Tässä onkin syytä olla tarkkana, sillä tästä seikasta voidaan löytää vihjeitä onkogeneesin alkuunpääsystä. 

 

Poikkeuksena muista Cdk-proteiineista Cdk8 ei vaadi T-silmukkansa fosforylaatiota ollakseen aktiivi (Hoeppner et al. 2005, Schneider et al. 2011).

Imettäväiskehoissa CDK8 moduli vaikuttaa p21 geenin ilmenemiseen. Tämä p21 proteiini kuuluu solusyklitekijöissä inhibiittorijoukkoon CKI ( Cyclin-dependent- Kinase Inhibitors), joiden tehtävänä on negatiivinen vaikutus G1 siirtymään blokeeraamalla Cdk1 ja Cdk2 kinaasiyksiköt.

p21 geenin mRNA pitoisuudet ja CDK8 geenin ilmeneminen ovat lineaarisessa korrelaatiossa. 

 

CDK8 ja p21 voivat myös tehdä suoraa interaktiota stimuloimalla CDK8 aktiivisuutta ja muodostamalla positiivisen takaisinsyöttö kierron ( positive feedback loop) Tämä mekanismi saattaa antaa suoraa linkkiä syövän kehittymiseen (Porter et al. 2012).

Ihmisen solulinjoissa CDK8 pitoisuuksien putoamana saattaa johtaa differentioitumiseen, kun taas proteiinipitoisuuksien nousu aiheuttaa pluripotentiaalisuutta (Adler et al. 2012).

CDK8 modulin on osoitettu linkkiytyvän myös Wnt/beta-kateniini-tiehen, joka on monimutkainen transkription säätöä signaloiva tie, josta Gap1/S siirtymä edistyy geeniekspression muuntuman kautta. CDK8 pystyy sitoutumaan beta-kateniinista riippuvaan c-Myc promottoriin Mediaattori-kompleksin osana ja täten voi suoraan vaikuttaa beta-kateniinin solupitoisuuksiin. (Firestein et al. 2008)

CDK8 voi vaikuttaa myös E2F1 aktiivisuuteen . E2F1 transkriptiotekijä aktivoi joukon geenejä, jotka liittyvät S-faasin progressioon. Myös E2F1 vaikuttaa Wnt/beta-kateniinitiehen koska se stimuloi niitä transkriptiofaktoreita, jotka edistävät beta-kateniinin hajoamista ja estää beta-kateniinin transkriptiota. CDK8 voi fosforyloida E2F1 proteiinin S375-aseman, mikä on kriittinen vastavaikuttamassa E2F1:n vaimentavaan (repressio) vaikutukseen beta-kateniinin kohdegeeneissä (Zhao et al. 2013)

E2F1 on avaintekijä solusyklin säätelyssä ja apoptoosin signaloimisessa.

• (Per Arne Aas: transkription säätymisestä: E2F-transkriptiofaktoriperhe on solusyklin avainsäätelijöitä E2F- perhe käsittää solusyklin säätelijöitten avainjäsenet.

Solusyklin säätelyssä omaavan osansa lisäksi Cdk8 saattaisi myös vaikuttaa  solujen erilaistumisen säätelyssä. Hiivasolulla on havaittu ravinteen energian ( glukoosin) ja typen saatavuuden merkitsevän erilaistumisohjelmassa, kasvussa ja morfologiassa. On havaittu vaikutusta G-proteiiniin kytkeytyneissä kalvokomplekseissa , MAPK-kaskadin aktivaatiossa, alavirtaproteiineissa, jotka voivat aktivoida transkriptiotekijöitä; niissä  on Cdk8 kohteita ja Cdk8 fosforylaatiota vaativia tekijöitä, joitten fosforylaatiosta seuraa normaalikasvukin.

• Haku PubMed Gene: CDK8

Näyttää geenillä  olevan toinenkin nimi: K35

Tämän geenin koodaama proteiini on sykliinistä riippuvan kinaasiperheen (CDK) jäsen. CDK perheenjäsenet ovat hyvin suuriasteisesti samanlaisia kuin alla mainittujen hiivojen geenituotteet ( joten hiivasolu on tämän modulin mitä adekvaatein tutkimusmiljöö) ja ne tunnetaan tärkeinä solusyklin progression säätelijöinä. Tämä kinaasi(Cdk8) ja sen säätelyllinen alayksikkö Cyclin C ovat  RNA polymeraasi II holoentsyymikompleksin osia , jotka fosforyloivat RNA polII isoimman alayksikön C-terminaalista domeenia. Tämä kinaasi Cdk8 säätelee myös transkriptiota siten, että se kohdistaa vaikutuksensa Cdk7/ TFIIH proteiineihin ( TFIIH tarkoittaa : Yleisen transkription aloittajafaktorin II :n sykliini H alayksikkö ). Täten muodostuu linkki ´Mediaattorin kaltaisten ` proteiinikompleksien ja basaalisen transkriptiokoneiston kesken.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1024

CDK8 cyclin-dependent kinase 8 [ Homo sapiens (human) 

Also known as

K35

Summary

The protein encoded by this gene is a member of the cyclin-dependent protein kinase (CDK) family. CDK family members are highly similar to the gene products of Saccharomyces cerevisiae cdc28, and Schizosaccharomyces pombe cdc2, and are known to be important regulators of cell cycle progression. This kinase and its regulatory subunit cyclin C are components of the RNA polymerase II holoenzyme complex, which phosphorylates the carboxy-terminal domain (CTD) of the largest subunit of RNA polymerase II. This kinase has also been shown to regulate transcription by targeting the CDK7/cyclin H subunits of the general transcription initiation factor IIH (TFIIH), thus providing a link between the 'Mediator-like' protein complexes and the basal transcription machinery. [provided by RefSeq, Jul 2008]

Väitöskirja (2005) Lindqvist A. Sykliinikaskadista, Mitoosin alusta (G1/S siirtymä, G2, M)

Väitöskirja (2005) Lindqvist A. Sykliinikaskadista, Mitoosin alusta (G1/S siirtymä, G2, M)

LÄHDE. Lindqvist Arne. Regulation of CDK dephosphorylation in mitotic entry.

Stockholm 2005. Karolinska Institutet. ISBN91-7140-362-0.
 http://swepub.kb.se/bib/swepub:oai:publications.ki.se:10616/39359?tab2=abs&language=en

Abstraktin suomennosta

Solusyklin progressio vaatii sykliinistä ( cyclin, Cyc) riippuvien kinaasien (Cyclin dependent kinase, Cdk) kaskadin, jossa kompleksin keskenään tehneet kinaasit ja sykliinit kompleksin aktivoiduttua ovat moottoreina.

Varhaisten mitoottisten tapahtumien avainsäätelijä on sykliini B1/Cdk 1-kompleksi. G2-faasissa sykliini B1/Cdk 1 pidetään inaktiivina siten, että Cdk1 - molekyylin aktiivikohdassa on fosforylaatio.

Cdc25 fosfataasien ( defosforylaasien) osuus

Ihmisen sykliini / Cdk – komplekseja pystyy aktivoimaan kolme Cdc25- defosforylaasi- perheen jäsentä, jotka ovat kaksoisspesifisyyttä omaavia fosfataaseja. Ne ovat Cdc25A, Cdc25B ja Cdc25C. Tutkijaryhmä pyrki saamaan tarkempaa tietoa sykliini B1/ Cdk 1 aktivaation säätelystä mitoosiin saapumisvaiheessa.

Työhypoteesina oli se, että solu kontrolloi osittain sykliini B1/ Cdk1- aktivaatiota säätelemällä Cdc25- proteiinien asettumista solussa. Tämän takia tutkittiin Cdc25A ja Cdc25B- molekyylien intrasellulaarista sijaintia. Havaittiin, että molemmat (Cdc25A ja Cdc25B) sijaitsevat nukleaarisesti, tumassa, vaikka ne jatkuvasti sukkuloivat sytoplasman ja tuman väliä ( shuttle) . Molemmissa molekyyleissä tunnistettiin nukleaariset ulosvientisekvenssit (nuclear export sequences, NES). Vaikka sekä Cdc25A NES ja Cdc25B NES olivat hyvin samankaltaisia, vain jälkimmäisessä havaittiin herkkyyttä inhibiittorille Exportiini-1.

Sitten kartoitettiin Cdc25A-molekyylistä tuman paikallistamissignaali ( nuclear localisation signal, NLS) ja vahvistettiin jo aiemmin todettu NLS myös molekyylistä Cdc25B.

Ultravioletille valolle (UV) reagoi Cdc25B translokoitumalla osittain tuman puolelle. Tähän siirtymään, translokaatioon, vaadittiin Cdc25B NES, p38 MAPK aktiviteetti ja vapaan14-3-3- sitoutuminen. Ehdotettiin seuraavaa: stressivasteena p38 MAPK välitti 14-3-3-sitoutumista Cdc25B-molekyyliin, mikä johti sytoplasmiseen kertymään. (Jokainen Cdc25 pystyy sitomaan 14-3-3 proteiinia, jolloin Cdc25 inhiboituu) .

RNA-interferenssimetodia käyttämällä (RNAi) vähennettiin eri Cdc25-molekyylien osuuksia, jotta saataisiin esiin niitten yksilölliset tehtävät.

Jos soluja käsiteltiin Cdc25A- tai Cdc25B-vähentävästi (siRNA avulla) siten, että Cdc25C-vaikutukseen ei puututtu, aiheutui viivästystä mitoosiin saapumisessa.

Mutta jos sekä Cdc25A että Cdc25B vähenivät ja jäljellä oli vain Cdc25C-vaikutus, solu pysähtyi G2-vaiheeseensa. Tästä pääätellään, että mitoosin induktorit ovat Cdc25A ja Cdc25B. Ajallisesti seurattaessa tapahtumaa ( time-lapse movies), vaikuttaa siltä, että Cdc25A säätää pääasiassa tuman tapahtumia, kun taas Cdc25B mahdollisesti osallistuu sekä tuman että sytoplasman tapahtumien säätelyyn.

Jos RNA-interfererenssimetodilla (RNAi ja siRNA) vähennettiin Cdc25B, mutta ei Cdc25A-molekyyliä, seurasi korkeampia pitoisuuksia fosforyloitua sykliini B1/Cdk 1 kompleksia erkanemattomissa sentrosomeissa kontrollisoluihin verrattuna. Tästä voitiin päätellä, että CdcB25 osallistui prosessiin, mistä seuraa aktiivin sykliini B1/Cdk 1- kompleksin akkumuloitumista solun centrosomeihin.

Seurattaessa sykliini B1/Cdk 1- aktivaatiota fosfospesifisillä antibodeilla, havaittiin aktiivia kompleksia sykliini B1/Cdk 1 kertyvän ensiksi centrosomeihin hieman ennen kuin ne alkavat migroitua erilleen. Sitten aktivaatio leviää sytoplasmaan ja kun 50 % komplekseista on aktiivoituneena, sykliini B1/Cdk 1 sytoplasmastakin alkaa translokoituu tumaan. Translokaation aikana sykliini B1/Cdk 1- kompleksin aktivaatio edistyy samalla tavalla tumassa kuin sytoplasman puolella. Tutkimuksessa ei havaittu mitään sykliini B1/Cdk 1-inaktivaatiota myöhäisessä metafaasissa. Saatu tieto tukee käsitystä bistabiliteetistä, joka hallitseee sykliini B1/Cdk 1 aktivaatiota.”

Terminologiasta muutama seikka:

P38 MAPK tunnetaan G1/S-siirtymän säätelijänä rb avulla. P38 säätelee p53 ja siirtymää faasirajalla G1/S.

KERTAUS kirjan kuvan tekstistä (kirjan sivulla 26)

Tekstiin kuuluu kuva mitoosiin saapumisvaiheesta, ja tässä on seuraavat spekulatiiviset komponentit esitettynä: vain tekstissä mainittuja molekyylejä käytetään kaavassa. (Cdc25fosfataasit eli defosforylaasit ja sykliini/Cdk-kompleksit, Cyc /Cdk eli solumoottorit, kinaasit ).

Aikajana: G2 –PROFAASI- PROMETAFAASI- METAFAASI.

(Tapahtumat sytoplasmassa.

Tapahtumat sytoplasman ja tuman välisissä kuljetuksissa (shuttle)

Tapahtumat tumassa)

G2 vaiheessa:

Cdc25A ja Cdc25B lisäsivät sykliini A ja sykliini B-expressiota ( CycA, CycB). mahdollisesti tämä tapahtui heikkoja CycA/Cdk2- ja CycB/Cdk1- aktiviteettejä luomalla.

Kun riittävä määrä sykliini B1/Cdk 1 kompleksia alkoi olla centrosomeissa, määrä aktivoitui Cdc25B- tekijällä, jarruttavan fosfaatin poistamisella. Sentrosomaalinen sykliiniB1/Cdk 1 aktivaatio johti centrosomien migraatioon.

Tuman sykliini A/Cdk2 aktivoitui sekä Cdc25A ja Cdc25B- tekijöitten avulla.

Sykliini A /Cdk 2 ja sykliini B1/Cdk 1 voivat aktivoitua synkronisoidusti, koska sekä Cdc25- ryhmä ja sykliini/Cdk-kompleksit voivat sukkuloida ( shuttle) sytoplasman ja tuman väliä.

PROFAASI

Tuman sykliiniA1/Cdk 2 aktivoituminen johti DNA-kondensaation alkamiseen.

PROMETAFAASI

Aktivoitunutta sykliini B1/Cdk 1 translokoitui tumaan kiihdyttämään DNA-kondensaatiota.

Kun tumakalvo oli hajonnut, Cdc25C piti yllä maksimaalista sykliini B1/Cdk 1-aktiviteettia.

Mahdollisesti Cdc25A ja Cdc25B myös jollain tavalla osallistuvat.

Cdc25C siis huolehti propagoitumisen, vaikka ei aktivoitumista sykliini B1/Cdk1-komponentissa.

METAFAASI

Ei todettu sykliini B1/Cdk1 inaktivaatiota vielä metafaasissa. Vasta kun kaikki kromosomit ovat liittyneet mikrotubuluksiin, sykliini B1 ohjataan hajoittumaan APC:n avulla ( Anaphase Promoting Complex)

Tulevia tutkimuskohteita mainittiin

Moni mitoosiin saapumisen mekanismiin liittyvä kysymys on vielä ratkaisematta Todennäköisimmin tähän osallistuu vielä tunnistamattomia valkuaisaineita. Tutkija mainitsee muutamia kiintoisia tutkimuskohteita kuten

• Millä tavalla, missä ja milloin Cdc25B hajoaa? On mahdollista, että Cdc25B ohjataan hajoitettavaksi SCF-avulla (Skp/Cullin/F-box protein). Jos niin on, mikä F-box välittää interaktion?

• Onko Pin 1 osallistumassa Cdc25B-aktivaatioon? Jos se osallistuu, kilpaileeko se pelkästään 14-3-3-kohdasta Cdc25B:n kanssa vai onko lisämekanismeja? ( Kaikki 14-3-3 proteiinit sitovat fosforyloituja epitooppeja. Kaikki Cdc25 voivat sitoutua 14-3-3- proteiineihin, jotkaa säätelevät monia soluprosesseja). Stimuloiko Plk 1( Polo-like kinase 1), Aurora A-, CyclinA/Cdk2 -tai Cyclin B1/Cdk 1-fosforylaatio Pin 1 sitoutumista? Tai päinvastoin: kiihdyttääkö Pin 1 isomerisaatio niiden fosforyloitumista Cdc25B:llä? Missä ja milloin Pin 1 on interaktiossa Cdc25B:n kanssa? (Pin 1 on isomeraasi, joka voi muuttaa kohteen struktuuria. Pin1 tunnistaa Cyc/Cdk-kompleksin).

• Mikä on Cdc25C:n osuus mitoosissa? Interferenssitutkimuksilla on osoitettu, että siRNA tätä Cdc25C.tekijää kohtaan tuottaa viivästyneen myöhäisprometafaasin. Onko sykliini B1/Cdk 1 aktiivisuus hieman alempi näissä soluissa ? Esim. muuttaako Cdc25C –puute bistabiliteettiominaisuuksia sykliini B1/Cdk 1 aktiviteetissa? Jos niin on, onko niissä soluissa mikrotubulaarisia dynamiikan eroja? Onko sentromeerisukkulajärjestelmän kontrollikohta aktivoitunut ? ( spindle assembly checkpoint – tässä katsotaan olevan p38-riippuvainen säätö).

• Milloin, miten ja missä sykliiniA/Cdk2 aktivoituu ? Toistaiseksi on tehty vain in vitro tutkimuksia tämän kompleksin aktivoitumisen suhteen. Heijastaako in vitro-tutkimukset sykliini A/Cdk2-aktiivisuutta in vivo-olosuhteissa?

• Miten solusyklin faasi vaikuttaa paikallistumisen dynamiikkaan ( localisation dynamics)? Lokalisaatiosignaaleihin sekä proteiinien ja rakenteitten interaktioihin mahdollisesti vaikuttavat erilaiset expressiotasot ja posttranslationaaliset modifikaatiot. Nykyinen edistys FRAP-analyyseissä ( Fluorescence Recovery After Photobleaching) mahdollistanee lähitulevaisuudessa multippeleitten interaktiokompleksien kokojen ja diffuusiovakioitten arvioimisen ( Sprague et McNally 2005). Kun tehdään systemaattisia FRAP ja FLIP tutkimuksia useista solukohdista eri solusyklivaiheitten aikana lukuisilla solusyklin säätelijöillä pystyttäisiin tekemään johtopäätöksiä interaktiokompleksien koosta ja liikkuuvuudesta.