USP1 (1p31.3) UBP, (DUB perheen alaryhmän USP- jäsen 1

USP1 toimii monissa DNA korjausteissä 

Lähde  https://link.springer.com/article/10.1007/s12013-013-9635-3

USP1 oli niitä ensimmäisiä luonnehdittuja ubikitiinihydrolaaseja hyvin määritellyssä DDR-tiessä. Osoitettiin, että USP1 hydrolysoi selektiivisesti monoubikitiiniliitännäisiä proteiineista FANCD2 ja PCNA. FA-proteiinin FANCD2 monoubikitinoiminen oli kriittisen tärkeä tehokkaalle ICL-DNA-korjaukselle (DNA-vauriosäikeen sisäiselle korjaukselle ) .

FANCD2-proteiinin monoubikitinoiminen ei epävakauttanut proteiinia. Molemmat proteiinimuodot olivat kyllä stabiileja, mutta monoubikitinoitu FANCD2 muoto pystyi säätymään solusyklistä riippuvalla tavalla. Kun FANCD2 proteiinin saa lysiini K561 kohtaan monoubikitiininsa, se lokalisoituu uudelleen ja asettuu tuman DNA-vaurion kohtaan ja pääsee tekemään interaktion BRCA1- proteiinin ja RAD51-rekombinaasin kanssa ja FANCD2 ja BRCA2 sijoittuvat näin samaan kohtaan.

USP1- DUB havaittiin seulottaessa entsyymejä, jotka estivät ubikitiinin irrottamista FANCD2:sta

Solusykli säätelee USP1-pitoisuutta kuten FANCD2-pitoisuuttakin ja USP1:n on nähty tekevät suoraa interaktiota FANCD2:n kanssa ja lokalisoituvan samaan kohtaan kromatiinin kanssa. Huomioitava on kuitenkin, että , in vitro, eristetyn USP1-proteiinin deubikitinoiva ominaisuus ei ole voimakas. Sen sijaan on tarpeen kofaktori UAF1 (WDR48), jotta muodostuu aktiivia USP1-muotoa. UAF1 (WDR48) on WD-toiston sisältävä proteiini, joka tekee stokiometrisen kompleksin USP1- kanssa soluissa ja aktivoi esiin USP1-kompleksin katalyyttisen kyvyn. Mekanistisesti UAF1 lisää USP1 kompleksin katalyyttistä vaihtuvuutta, mutta ei lisää USP1:n affiniteettia substraattiinsa.

Tämän deubikitinaasiluokan peptidaaseilla on tavallinen säätelyllinen piirteensä: säätyminen DUB-kofaktoreilla tai substraattiin sitoutumisella.

Lisäksi on osoitettu, että USPI DUB poistaa monoubikitiinin PCNA:sta, joten se säätelee trans-leesionaalisen-DNA-synteesin (TLS) varhaisia vaiheita. TLS on prosessi, jossa spesiellit DNA-polymeraasit tekevät vaurion ohituksen translesionaalisella DNA synteesillä.

Myös interaktio UAF1 ja ELG1-proteiinien kesken rekrytoi USP1/UAF1-kompleksin monoubikitinoidulle PCNA:lle. ELG1 on proteiini, joka osallistuu replikaatiokompleksiin ja PCNA:n lataamiseen DNA:lle tehokasta replikaatiota varten; ELG1 on tunnistettu itsenäisenä tekijänä , jota tarvitaan vaimentamaan genomista instabiliteettiä.

Terminologiaa:

APC/C , Anaphase Promting Complex/Cyclosome, ( N-terminal WD40 domain stimulates catalytic activity of Apc1)

bHLH TF, basic helic loop helix transcription factor ( i.e. MYC, MYCN, HIF1A, TCF3,…)

BRCA1 (FANCS), DNA repair associated , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=BRCA1

BRCA2 (FANCD1), DNA repair associated, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/675

RAD51, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5888; DNA repair protein RAD51 homolog; BRCA1/BRCA2 containig complx, subunit 5)

CHK1 Checkpoint Kinase 1 (Kr.11q24.2) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111

CPT, camptothecin, a topoisomerase I inhibitor

DUB, Deubiquitinase

DSBR Double strand break repair

DDR, Damaged DNA Repair

ELG1, Enhanced level of Genomic Instability homolog 1, Chromosomal fragility associated gene 1 protein, ATAD5 , ATPase family AAA domain containig 5. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/79915).

FANCD2, FA complementation group D2, https://en.wikipedia.org/wiki/FANCD2,

FA Fanconi Anemia

HR Homologous recombination

ICL DNA repair, DNA interstrand crosslink repair

Ku70, a key regulator of DSB repair by NHEJ.XRCC6 (Kr.22q13.2),(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2547).

MMC, mitomycin C

NER, Nucleotide excision repair

NHEJ, Non-Homologous End Joining

PCNA Proliferating cell nuclear antigen , ATLD2 ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5111)

polymerase kappa, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_057302.1

TLS, Translesional DNA synthesis

UAF1 (WDR48) , UASP1 Associated factor 1, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/57599)

USP1, Ubiquitin specific proccessing protease 1, UBP, (1p31.3) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7398

• USP1 Functions in Multiple Repair Pathways

• The USP1 protein was one of the first ubiquitin hydrolases characterised as a key player in a well-defined DDR pathway. Thus, it was shown that USP1 selectively hydrolyses mono-ubiquitin adducts from the proteins FANCD2 and PCNA [62, 63]. Mono-ubiquitylation of the FA protein FANCD2 is critical for effective ICL DNA repair. The mono-ubiquitylation of FANCD2 does not destabilise the protein: both forms of the protein are equally stable; however, mono-ubiquitylation of FANCD2 is regulated in a cell cycle-dependent manner.
• Upon mono-ubiquitylation on lysine 561, FANCD2 re-localises to nuclear DNA-damage foci, where it interacts with BRCA1 and the RAD51 recombinase and co-localises with FANCD2 and BRCA2 [64, 65, 66]. Interestingly, USP1 was identified in a screen for enzymes that prevent the removal of ubiquitin from FANCD2 [62].
• Like mono-ubiquitylated FANCD2, USP1 levels are regulated during the cell cycle, and USP1 has also been shown to interact directly with FANCD2 and to co-localise with chromatin. Notably, however, the isolated USP1 protein does not display strong deubiquitylating activity in vitro. Instead, the co-factor, UAF1 (WDR48), is necessary to form an active USP1 enzyme. UAF1 (WDR48) is a WD40 repeat-containing protein that forms a stoichiometric complex with USP1 in cells and activates the catalytic activity of the USP1 complex [67]. Mechanistically, UAF1 increases the catalytic turnover (k _cat), but does not increase the affinity of USP1 for its substrate (K _M). Regulation of DUBs by co-factors or upon substrate binding is a common regulatory feature of that class of peptidases.
• In addition, USP1 has also been shown to remove mono-ubiquitin from PCNA, thus regulating one of the earliest steps of trans-lesion DNA synthesis (TLS)—a process in which specialised DNA polymerases synthesise DNA past a DNA lesion [63, 67].
• The USP1/UAF1 complex is also recruited to mono-ubiquitylated PCNA via an interaction between UAF1 and the protein ELG1, a protein involved in replication complexes and in loading PCNA onto DNA for efficient replication, and independently identified as a factor required to suppress genomic instability [68, 69].

Alkuhavainnot USP1:stä viittasivat siihen, että matalat USP1-pitoisuudet voisivat suojata soluja

DNA-vaurioilta. Kuitenkin jatkotutkimuksissa arvioitiin USP1:n osuus uudestaan geeni-inaktivaatiotutkimuksilla hiiressä ja osoittautui selväksi, että USP1:n - poisto johti genomiseen epävakauteen. -Kohdennettu geenideleetio hiiressä (usp1-/-) johti lisääntyneeseen perinataaliin kuolleisuuteen ja hiiriurosten infertiliteettiin, DNA-poikkisidosten hypersensitiivisyyteen ja Fankonianemiafenotyyppiin. Usp1-/- hiirialkiofibroblastit osoittivat kohonneita pitoisuuksia monoubikitinoituja FANCD2 kromatiinissa ja FANCD2:n fokaalisen koostuman virheitä ja DNA korjaustien HR puutttellisuutta. Kaksoispoistogeenisyys (Usp1/Fancd2) hiirissa osoitti korkeamman tason DDR-vikatoimintaa kuin yksittäisen Usp1:n geeninpoistotila, mikä viittaisi USP1:n omaavan DNA vauriovasteessa (DDR) muitakin tehtäviä kuin vaikutukset FANCD2:een.

Lisätukea saatiin myöhemmin USP1:n kriittisesta osasta soulun suojeluksessa DNA-vaurioilta . Tutkittiin kananpojan DT40-soluilla geenin poistoa. Siitä aiheutui solujen hypersensitiivisyyttä DNA:ta vaurioittaville aineille, mikä vahvasti puoltaa stiä mallia, että USP1 on DNA:n korjauksen positiivinen säätelijä. USP1-kompleksin irrotus DT40 -soluista johti myös lisääntyneeseen yliherkkyyteen kamptotesiiniä (camptothecin, CPT, eräs topoisomeraasi-I-inhibiittori), poly (ADP-riboosi) polymeraasi-inhibiitoreita ja DNA- poikkisidoksia aiheuttavaa agenssia mitomysiini-C: tä (MMC) kohtaan, ja lisäksi defekteihin HR korjaustiehen. Nämä muutokset voitiin palauttaa pois, jos Ku70 poistettiin ( Se on NHEJ- DNA korjaustiessä avainsäätelijä). Täten USP1- kompleksi on kriittinen ICL korjauksen ja HR korjaustien säätelijä ja yhdessä FA-tien kanssa sillä on yleensä osatehtävänä vaimentaa NHEJ- korjaustie.

• Initial observations indicated that reduced levels of USP1 would protect cells from DNA damage [62, 63]; however, follow-up studies evaluating the role of USP1 in gene inactivation studies in mice have clearly demonstrated that USP1 depletion results in genomic instability. Targeted deletion of mouse Usp1 results in elevated perinatal lethality, male infertility, DNA cross-linker hyper-sensitivity, and a FA phenotype. Usp1 ^−/− mouse embryonic fibroblasts display heightened levels of mono-ubiquitylated FANCD2 in chromatin and exhibit impaired FANCD2 focus assemblyand a defect in HR repair. Interestingly, Usp1/Fancd2 double knock-out mice display a higher level of DDR dysfunction than in the Usp1 single knock-out condition, suggesting additional DDR roles for USP1 beyond its effects on FANCD2 [70].
  
  Additional support for a critical role played by USP1 in protecting cells against DNA damage was obtained from a study in chicken DT40 cells: Usp1 disruption resulted in cellular hypersensitivity to DNA damaging agents, strongly supporting a model, whereby, USP1 is a positive regulator of DNA repair [71]. Disrupting the USP1 complex in DT40 cells also leads to increased sensitivity to camptothecin (CPT) (a topoisomerase I inhibitor), poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors and the DNA cross-linking agent mitomycin C (MMC), together with defects in HR. These defects were largely rescued by removing Ku70, a key regulator of DSB repair by NHEJ. The USP1 complex is thus, a critical regulator of ICL repair and HR and, together with the FA pathway in general, it has a role in suppressing NHEJ [72].

Sillä aikaa kun replikaatiohaarukassa on pysähtyminen, CHK1 fosforylaatio kontrolloi G2/M- tarkistuskohtaa. Viimeaikainen näyttö viittaa siihen, että USP1 kontrolloi sitä takaisinsyöttösilmukkaa, joka rajoittaa CHK1-aktiivisuutta DNA-vauriosolujen pelastamisessa. Vaurioituneitten solujen toipumiseen osaltaan vaikuttavaa takaisinsyöttömekanismia edustanee CHK1:n - hajoituksen stimuloituminen monoubikitinoidun FANCD2:n välityksellä.

Lisäksi USP1 on tarpeen estämässä DNApolymeraasi K:n poikkeavaa rekrytoimista replikaatiohaarukkaan. Jos K-polymeraasin rekrytointi puuttuu replikaatiohaarukasta, seuraa alentunut replikaatiohaarukan nopeus ja lisääntynyt genominen instabiliteetti. Prosessia vaikuttaa USP1 ja se generoituu alkuun tuloksena PCNA:n lisääntyneestä polyubikitinoitumisesta.

Viime aikoina on myös osoitettu NER- DNA-korjausjärjestelmässä PCNA:n monoubikitinoitumista ja TLS-polymeraasin rekrytoitumista UV- vaurioihin :

NER (Nucleotide excision repair) DNA:n korjausmenetelmä voi tapahtua myös replikaatiofaasin ulkopuolella

USP1-pitoisuuksia kontrolloi proteiinitasossa APC/C .

Matalat USP1-pitoisuudet tekevät mahdolliseksi runsaat UV:n aiheuttamat PCNA-monoubikitinaatiot solusyklin G1-vaiheen aikana, mistä taas mahdollistuu TLS-polymerasien rekrytoituminen UV-leesiokohtiin.

• During replication fork stalling, the G2/M checkpoint response is controlled by CHK1 phosphorylation. Recent evidence suggests that USP1 controls a feedback loop that limits CHK1 activity to rescue DNA-damaged cells. Stimulation of CHK1 degradation by mono-ubiquitylated FANCD2 may thus, represent a feedback mechanism that contributes to the recovery of damaged cells [73]. In addition, USP1 is required to prevent aberrant recruitment of DNA polymerase Κ to replication forks. Lack of recruitment of polymerase Κ to the replication fork results in decreased replication fork speed and enhancement of genomic instability. The process is USP1 driven and generated as a result of elevated PCNA ubiquitylation [74]. PCNA mono-ubiquitylation and trans-lesion synthesis (TLS) polymerase recruitment to UV lesions have also recently been implicated in
• NER, a DNA repair mechanism that can take place outside of the replication phase [75].
• USP1 levels are controlled at the protein level by APC/C^Cdh1. Low levels of USP1 enable robust UV-induced PCNA mono-ubiquitylation during G1, which is likely to allow recruitment of TLS polymerases to UV lesions [76].

On löydetty myös eräs uusi USP1 deubikitinaatioaktiivisuus. USP1 säätelee DNA:ta sitovien proteiinien estäjiä (DI). Nämä estäjäproteiini antagonisoivat bHLH-transkriptiotekijöitä estäen differentioitumisen ja pitävät yllä kantasolutilaa. Eri kudoksissa tapahtuu näiden ID- proteiinien ubikitinoitumista ja proteosomaalista silppuroitumsita, mutta monissa neoplasmoissa nämä inhibiittorit näyttävät välttyvän hajoitukselta . Ei ole täydelleen selvitetty, onko tällä ID-proteiinien säätelyllä jotain linkkiä USP1:n tunnettuihin funktioihin DNA-vauriovasteen säätelyssä .

Samassa tutkimuksessa kirjoityajat kuitenkin pystyivät osoittamaan, että USP1 katalyyttisellä DUB-aktiivisuudellaan edisti in vitro transformaatiota ja in vivo tuumorin muodostumista, mikä edelleen tuki sitä mallia, jossa USP1 toimisi onkogeenisesti.

Yhteenvetona USP1:n avain rooleista DNA:n korjaantumisien edistämisessä voidaan sanoa näiden löytöjen valaisevan USP1:n mahdollisuutta olla kiinnostava kehiteltävien antisyöpälääkkeiden kohdemolekyyli.

• A novel function for USP1 deubiquitylating activity has recently been uncovered: USP1 regulates the stability of ID (inhibitors of DNA binding) proteins [77]. ID proteins antagonise basic-helix–loop–helix (bHLH) transcription factors to inhibit differentiation and maintain stem cell fate [78]. ID ubiquitylation and proteasomal degradation occur in differentiated tissues, but IDs appear to escape degradation in many neoplasms [79]. Whether or not the regulation of ID proteins is linked to the known functions of USP1 in regulating DNA damage responses or not remains to be fully determined. In the same study [77], the authors were able to demonstrate that USP1, through its catalytic DUB activity, promotes in vitro transformation and in vivo tumour formation, thus further supporting models in which USP1 acts as an oncogene.
  
   Taken together with its key roles in promoting DNA repair, these findings highlight the potential of USP1 as an attractive target for developing anti-cancer drugs.

Suomennosta linkissä mainitusta  lähteestä kohdasta USP1.  30.6. 2018.