Leta i den här bloggen


fredag 27 juli 2018

Kahvitauko

“Coffee break”
Kahvin molekyylit ovat kun valkuaisainekatabolian lopputuotteita puriinilinjasta. Miten ne vaikuttavat DNA:korjausmekanismeihin?
Onko se genomille vaarallinen?

Caffeine impairs resection during DNA break repair by reducing the levels of nucleases Sae2 and Dna2

Nucleic Acids Research, Volume 43, Issue 14, 18 August 2015, Pages 6889–6901, https://doi.org/10.1093/nar/gkv520
Published:
27 May 2015
Article history Abstract
Suomennosta:
Vasteen kromosomin kaksoiskatkoille eukaryoottiset solut aktivoivat DNA-vauriontarkistuskohdan, jossa toimii yhteistyössä PI3-kinaasin kaltaiset proteiinikinaasis ATR ja ATM ( hiivassa Mec1 ja Tel1). Sen jälkeen kun kaksoiskatko on muodostunut Mec1 ja Tel1 fosforyloivat histonin H2A seriinin 129 joka tunnetaan gamma-H2AX- nimisenä. Tutkijat käyttivät kaffeiinia inhiboimaan tarkistuskohtakinaaseja DSB-induktion jälkeen. He osoittivat, että pitkittynyt H2A-S129 fosforylaatio ei vaadi jatkuvaa Mec1 ja Tel1- aktiivisuutta.
Odottamaton löytö kaffeiinin käytöstä oli huonontunut HR , homologinen rekombinaatio johtuen 5´ -3´ pääteresektion estymisestä riippumatta Mec1 ja Tel1 inhibitiosta. Kahvikäsittely johti kahden nukleaasin nopeaan hajoittumiseen proteosomisilppurissa. Toinen näistä oli nukleaasi Sae2, joka omaa osan resektion varhaisvaiheessa ja toinen oli nukleaasi Dna2, jonka tehtävä on nopeuttaa tiusta kahdesta laajasta resektiotiestä. Sae2-instabiliteetti on ilmeistä, kun ei ole DNA vauriota. Samankaltainen Sae2-kato tapahtuu sykloheximidivaikutuksesta. Kaffeiinikäsittelyllä on samanlaista vaikutusta säteilytettyihin HeLa-soluihin, joissa se blokeerasi RPA muodostumisen ja Rad51-fokukset, jotka riippuvat 5´- 3´-resektiosta, trimmauksesta, katkenneissa kromosomipäädyissä. Löydöistä tulee oivallusta kaffeiinin käyttöön DNA-vaurion++ herkistävänä agenssina syöpäsoluissa.
  • I response to chromosomal double-strand breaks (DSBs), eukaryoticcells activate the DNA damage checkpoint, which is orchestrated by the PI3 kinase-like protein kinases ATR and ATM (Mec1 and Tel1 in budding yeast). Following DSB formation, Mec1 and Tel1 phosphorylate histone H2A on serine 129 (known as γ-H2AX). We used caffeine to inhibit the checkpoint kinases after DSB induction. We show that prolonged phosphorylation of H2A-S129 does not require continuous Mec1 and Tel1 activity. Unexpectedly, caffeine treatment impaired homologous recombination by inhibiting 5′ to 3′ end resection, independent of Mec1 and Tel1 inhibition. Caffeine treatment led to the rapid loss, by proteasomal degradation, of both Sae2, a nuclease that plays a role in early steps of resection, and Dna2, a nuclease that facilitates one of two extensive resection pathways. Sae2's instability is evident in the absence of DNA damage. A similar loss is seen when protein synthesis is inhibited by cycloheximide. Caffeine treatment had similar effects on irradiated HeLa cells, blocking the formation of RPA and Rad51 foci that depend on 5′ to 3′ resection of broken chromosome ends. Our findings provide insight toward the use of caffeine as a DNA damage-sensitizing agent in cancer cells.
Issue Section:

Johdannon suomennosta

INTRODUCTION

DNA kaksoiskatkokset ovat hyvin vahingollisia tapahtumia, jotka voivat johtaa kromosomipoikkevuuksiin, solukuolemaan ja syöpään. Kromosomikatokejn korjaus tapahtuu useilla hyvin konservoiduilla teillä. G1 faasin solut ensisijaisesti korjaavat kaksoiskatkon liittämällä uudelleen katkenneet päät ei-homologisella päätteitten liitännällä (NHEJ) . Kun solut ovat ohittaneet “starttikohdan” matkallaan S-faasin alkuun, korjauksen päätie vaihtuu homologiseksi rekombinaatioksi HR. Aloitusvaihe ja olennainen askel HR-tiessä on dsDNA:n 5´- 3´-resektio kaksoiskatkon päädyissä, trimmaus, mistä jää trimmattuna jäljelle yksisäikeisiä 3´ päätyjä (ssDNA) Näyttö sekä in vivo että in vitro viittaa siihen, että resektioN alkaa MRX-kompleksi Mre11-Rad50-Xrs2 yhdessä Sae2 nukleaasin kanssa;  kasvavassa hiivassa homologi on CtIP.
Sae2 on havaittu in vitro-tutkimuksessa nopeuttamassa 5´- 3´ resektiota edistämällä Mre11:n endonukleaasiaktiivisuutta, vaikka oletetaan Sae2:lla itsellään olevan nukleaasiaktiivisuutta. Laajempi resektio riippuu kahdesta eri nukleaasiaktiivisuudesta: toinen käsittää Exo1 ja toinen osallistuva on kompleksi, jossa on Dna2, Sgs1, Top3 ja Rmi1.YksisäikeiEnn DNA-häntä, joka muodostuu resektiolla on ensin replikaatioproteiini A:n peittämä (RPA) ja se tekee interaktion Rad52:n kanssa nopeuttaen Rad51-rekombinaatioproteiinifilamentin muodostumista. Rad51- filamentti katalysoi ssDNA:lle homologisten sekvenssien etsintää läpi genomin ja edistää säikeen invasoitumista ssDNA:n ja homologisen dsDNA:n välissä. Säieinvaasiota seuraa DNA-synteesin aloitus invAsoituvan säikeen 3´-päädystä ja mahdollisesti DSB korjaantuu.
  • DNA double strand breaks (DSBs) are highly deleterious events that may lead to chromosomal abnormalities, cell death and cancer. Repair of chromosome breaks occurs by several highly conserved pathways. G1 cells predominantly repair DSBs by re-joining the broken ends through nonhomologous end-joining (NHEJ) pathways (1,2). After the cells pass ‘start’ on their way to initiate S phase, the main pathway of repair shifts to homologous recombination (HR) (2–4). An initial and essential step in HR is the 5′ to 3′ resection of the dsDNA at the DSB end, which leaves 3′ single-stranded DNA (ssDNA) tails. Both in vivo and in vitro evidence suggests that resection is initiated by the Mre11-Rad50-Xrs2 complex (MRX) together with Sae2, the budding yeast homolog of CtIP (5–8). Recently, Sae2 has been shown in vitro to facilitate 5′ to 3′ resection by promoting the endonuclease activity of Mre11 (9), although Sae2 itself has been suggested to have nuclease activity (10). More extensive resection depends on two separate nuclease activities, one involving Exo1 and another involving a complex containing Dna2, Sgs1, Top3 and Rmi1 (6,7,11,12). The ssDNA tail created by resection is first coated by replication protein A (RPA) that interacts with Rad52 to facilitate the formation of a filament of the Rad51 recombination protein (13–15). The Rad51 filament catalyzes a search throughout the genome for sequences homologous to the ssDNA within the filament and promotes strand invasion between the ssDNA and homologous double-stranded DNA (dsDNA). Strand invasion is followed by the initiation of DNA synthesis from the 3′ end of the invading strand and eventual repair of the DSB (16,17).
Kun tapahtuu kaksoiskatko (DSB) sekvensseissä, joilla on molemmissä katkospäädyissä homologiaa templaatin sekvenssin kanssa (sisarkromatidi, jokin homologi kromosomi tai ektooppinen donori), korjaantuminen tapahtuu geenikonversiolla (GC). Jos vain toinen pääty kykeenee pariutumaan homologisiin sekvensseihin, korjaantuminen ediStyy rekombinaatiosta riippuvalla prosessilla, joka on katkoksen indusoimaa replikaatiota (BIR). Korjaantuminen voi tapahtua myös Rad51:stä riippumattomalla tavalla myöstäämällä yksittäistä DNA-säiettä (SSA, single strands annealing), jos on kaksoiskatkoksen sivuilla homologisia sekvenssejä.
  • When the DSB occurs in sequences that share homology on both ends of the break with a template sequence (a sister chromatid, a homologous chromosome or an ectopic donor) repair occurs by gene conversion (GC). If only one end of the DSB is capable of pairing with homologous sequences, repair proceeds by a recombination-dependent process termed break-induced replication (BIR) (18,19). Repair can also occur in a Rad51-independent fashion by single-strand annealing (SSA) when there are homologous sequences flanking a DSB (20).
Jotta korjaantumiseen saa riittävästi aikaa ja mitoosi estyisi murtuneen kromosomin läsnäollessa, solut aktivoivat DNA-vaurion tarkistuskohdan. Kaksi tarkistuskohdan PI3-kinaasin kaltaista proteiinikinaasia ,ATM ja ATR (Tel1 ja Mec1 hiivassa) rekrytoituvat kaksoiskatkoon (DSB) ja fosforyloivat alavirran effektorien kaskadin, mikä estää soluja jakaantumasta kunnes vaurio on korjattu. Silmukoivassa hiivassa tukiproteiini Rad9 rekrytoituu kaksoiskatkoon ja siinä fosforyloituu Mec1:n toimesta. Rad9 välittää sitten Rad53 (Chk2) ja Chk1-proteiinien autofosforyloitumisen. Rad9 fosforyloi Cdc20 ja inhiboi sen (APC-aktivaattorin, anafaasia edistävän kompleksin aktivaattorin) Tämä inhibitio Chk1:n aktivaation ohella stabilisoi Pds1:n, sekuriinin, ja estää mitoosin. Kun korjaus on tehty valmiiksi, DNA-vaurion tarkistuskohta menee off-tilaan ja sallii solujen ryhtyä jälleen solusyklin progressioon ja tämä on toipumista, recovery. Jos vauriota ei pystytä korjaamaan, solut voivat mahdollisesti asettaa tarkistuskohdan OFF- tilaan adaptaatioprosessillla.
  • In order to allow sufficient time for repair, and to prevent mitosis in the presence of a broken chromosome, cells activate the DNA damage checkpoint. Two checkpoint PI3 kinase-like protein kinases, ATM and ATR (Tel1 and Mec1 in yeast, respectively), are recruited to the DSB and phosphorylate a cascade of downstream effectors that, in turn, prevent the cells from dividing until the damage is repaired (21–24). In budding yeast, the scaffolding protein Rad9 is recruited to the DSB, where it is phosphorylated by Mec1 (24). Rad9 then mediates the autophosphorylation of Rad53 (Chk2) and Chk1 (22,25). Rad53 phosphorylates and inhibits Cdc20, an activator of the anaphase-promoting complex. This inhibition, along with activation of Chk1, stabilizes Pds1 (securin) and prevents mitosis (22,26). After repair is complete, the DNA damage checkpoint is turned off to allow the cells to resume cell cycle progression, a process termed recovery. If the damage cannot be repaired, the cells can eventually turn off the checkpoint by a process termed adaptation (27,28).
Toinen Mec1 ja Tel1-kinaasien aktiivisuuden kohde on histonin H2Aseriini129. Tämä modifikaatio, gamma-H2AX on evolutionaalisesti konservoitunut. ATM ja ATR voivat nopeasti fosforyloida imettäväisen HsAX-S139 seriinin vasteena DNA-vaurioon. Modifikaatio leviää 100 kb:n mitan DSB-vaurion ympärillä hiivasoluissa ja 1Mb imettäväissolun DSB-vaurion ympärillä ja se toimii korjaustekijöiden rekrytoimisessa DSB.vaurion läheisyyteen. Jos soluista puuttuu kyky fosforyloida H2A-S129 (H2A-S129A), ne adaptoituvat luonnollista solua nopeammin, mikä viittaa siihen, että tällä modifikaatiolla on merkitystä jarruttuman keston pituudelle. Yllättävää kyllä on että histonia H2A-S129A ilmentävät histonit omaavat 5´-3´- resektiotahdin DSB-päädyissä , mikä on suurempi kuin luonnonsoluissa (6,8 kb/h versus 4 kb/h), mikä viittaa taas siihen että enempi ssDNA tai resektiosivutuotteiden määrä ei sinänsä tai itsestään signaloi tarkistuskohdan ylläpitoa. Gamma-H2AX hiivassa on nopeasti poistunut korjaukseen jälkeen kromatiinista vielä tuntemattoman faktorin toimesta ja sitten defosforyloituu PP4 fosfataasikompleksilla.
  • Another target of Mec1 and Tel1 kinase activity is serine 129 of histone H2A. This modification, termed γ-H2AX, is evolutionarily conserved; ATM and ATR rapidly phosphorylate mammalian H2AX-S139 in response to DNA damage (29–32). The modification spreads as far as 100 kb around the DSB in yeast cells, and 1 Mb around a DSB in mammalian cells, and serves to recruit repair factors to the vicinity of the DSB (29,31,33). Cells that lack the ability to phosphorylate H2A-S129 (H2A-S129A) adapt faster than WT cells, suggesting this modification plays a role in determining the length hiivaof arrest (34,35). Surprisingly, cells expressing histone H2A-S129A have a rate of 5′ to 3′ resection of the DSB ends greater than that in WT cells (6.8 kb/h versus 4 kb/h), which implies that having more ssDNA or more resection byproducts does not, in and of itself, signal for checkpoint maintenance (36,37). γ-H2AX in yeast is rapidly removed from chromatin after repair by a yet unknown factor and then dephosphorylated by the PP4 phosphatase complex (38).
Kysymys on, onko Mec1 ja Tel1 konstitutiivisesti vaadittu pitämään yllä gamma-H2AX:ta sen muodostumisen jälkeen. Tutkijat käyttivät kaffeiinia estämään Mec1 ja Tel1 nukleaasit sen jälkeen kun gamma-H2AX oli muodostunut. Kaffeiini toimi PI3K-inhibiittorina ja sen on osoitettu inhiboivan ATM ja ATR imettäväissoluissa ja kahdessa hiivassa.Tutkijat havaitsivat,että gamma-H2AX jää pysyttelemään DSB:n ympärillä kaffeiinikäsittelyn jälkeen, mikä viittaa siihen, että modifikaatio on stabiili eikä riipu jatkuvasta Mec1/Tel1-aktiivisuudesta.
  • Here we asked if Mec1 and Tel1 are constitutively required to maintain γ-H2AX after its formation. We used caffeine to inhibit Mec1 and Tel1 after the formation of γ-H2AX. Caffeine acts as a PI3K inhibitor and has been shown to inhibit ATM and ATR in mammalian cells, Schizosacchromyces pombe and Saccharomyces cerevisiae (39–45). We find that γ-H2AX is retained around a DSB after caffeine treatment indicating that the modification is stable, and does not depend on continuous Mec1/Tel1 activity.
Imettäväissoluissa tuumorisuppressori p53 aktivoituu DNA-vaurion jälkeen G1 faasissa ja pitää yllä vahvaa G1-tarkistuskohtaa. Päinvastoin S-faasin ja G2/M- tarkistuskohta ovat täysin riippuvaisia ATM:stä ja ATR:stä, eivätkä tarvitse p53:a. Todellakin kaffeiinikäsittely osoittautui sensitoivan p53- vajeiset tuumorisolut jonisoivalle säteilylle.Tämän vaikutuksen oletettiin tapahtuvan kaffeiinivälitteisein G2/M-tarkistuskohdan eston takia. Kuitenkaan kaffeiini ei pystynyt enempää säteilyherkistämään imettäväis- tai DT-40-soluja, joista HR puuttui- tämä viittaisi siihen, että herkistysmekanismi käsittäisi pikemminkin HR-inhibition kuin tarkistuskohdan kontrollin inhibition. Tuore tutkimus osoitti, että kaffeiinilla käsittely osallistui imettäväisten Rad51- välitteisen linkkimolekyylin muodostamiseen in vitro ja geenikohdennuksessa in vivo.
  • In mammalian cells, the tumor suppressor p53 becomes active following DNA damage in the G1 phase, and maintains a robust G1 checkpoint (46). In contrast, the S phase and G2/M checkpoints are completely dependent on ATM and ATR, and do not require p53 (46). Indeed, caffeine treatment was shown to sensitize p53-deficient tumor cells to ionizing irradiation. This effect was hypothesized to occur due to the caffeine-mediated inhibition of the G2/M checkpoint (47–49). However, caffeine could not further radiosensitize both mammalian and DT-40 cells that are deficient for HR, suggesting that the mechanism of sensitization involves inhibition of HR rather than checkpoint control (50–52). A recent study showed that caffeine treatment interferes with mammalian Rad51-mediated joint molecule formation in vitro as well as gene targeting in vivo (53).
Tässä tutkijat osoittivat, että kaffeiini heikentää kasvassa hiivassa ja Hela soluissa resektiota (trimmausta) . He osoittivat kasvavalla hiivalla, että HR-inhibitiota tapahtuu riippumatta DNA-vauriotarkistuskohdan inhibitiosta korjauksen ensimmäiseen vaiheeseen puuttumalla. Resektion (trimmauksen) huonontuminen korreloi Sae2 ja Dna2 nukleaasien runsauden vähentymään kaffeiinikäsitelyn jälkeen. Tutkijat osoittavat, että molemmat nukleaasit kohdentuvat proteosomisilppuriin hajoittumaan. Erityissti he osoittavat, että Sae2 on epävakaa proteiini, koska se hajoaa nopeasti kaffeiinista tai sykloheximidistä (CHX)- silloinkin kun DNA-vauriota ei ole. Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen,
 että kaffeiinikäsittely kohdentaa homologisen rekombinaation (HR) varhaisimpiin vaiheisiin riippumatta sen ATM/ATR-inhibitiosta.
  • Here we show that caffeine treatment impairs resection in budding yeast and HeLa cells. We show in budding yeast that inhibition of homologous recombination occurs independently of inhibition of the DNA damage checkpoint, by interfering with the first step in repair: resection of the DSB ends. The impairment of resection correlates with a reduction in the abundance of both Sae2 and Dna2 following caffeine treatment. We show that both nucleases are targeted for proteasomal degradation. In particular, we show that Sae2 is an unstable protein, as it is degraded rapidly following caffeine or cycloheximide (CHX) treatment even in the absence of DNA damage. Taken together, these data suggest that caffeine treatment targets one of the earliest steps in HR, independent of its inhibition of ATM/ATR.




Inga kommentarer:

Skicka en kommentar