“Coffee break”
Kahvin molekyylit ovat
kun valkuaisainekatabolian lopputuotteita puriinilinjasta. Miten ne
vaikuttavat DNA:korjausmekanismeihin?
Onko se genomille
vaarallinen?
Caffeine impairs resection during DNA break repair by reducing the levels of nucleases Sae2 and Dna2
Michael
Tsabar Vinay V. Eapen Jennifer
M. Mason Gonen Memisoglu David
P. Waterman Marcus J. Long Douglas
K. Bishop James E. Haber
Nucleic Acids
Research, Volume 43, Issue 14, 18 August 2015, Pages 6889–6901,
https://doi.org/10.1093/nar/gkv520
Published:
27 May 2015
Suomennosta:
Vasteen kromosomin
kaksoiskatkoille eukaryoottiset solut aktivoivat
DNA-vauriontarkistuskohdan, jossa toimii yhteistyössä PI3-kinaasin
kaltaiset proteiinikinaasis ATR ja ATM ( hiivassa Mec1 ja Tel1). Sen
jälkeen kun kaksoiskatko on muodostunut Mec1 ja Tel1 fosforyloivat
histonin H2A seriinin 129 joka tunnetaan gamma-H2AX- nimisenä.
Tutkijat käyttivät kaffeiinia inhiboimaan tarkistuskohtakinaaseja
DSB-induktion jälkeen. He osoittivat, että pitkittynyt H2A-S129
fosforylaatio ei vaadi jatkuvaa Mec1 ja Tel1- aktiivisuutta.
Odottamaton löytö
kaffeiinin käytöstä oli huonontunut HR , homologinen
rekombinaatio johtuen 5´ -3´ pääteresektion estymisestä
riippumatta Mec1 ja Tel1 inhibitiosta. Kahvikäsittely johti kahden
nukleaasin nopeaan hajoittumiseen proteosomisilppurissa. Toinen
näistä oli nukleaasi Sae2, joka omaa osan resektion
varhaisvaiheessa ja toinen oli nukleaasi Dna2, jonka tehtävä on
nopeuttaa tiusta kahdesta laajasta resektiotiestä.
Sae2-instabiliteetti on ilmeistä, kun ei ole DNA vauriota.
Samankaltainen Sae2-kato tapahtuu sykloheximidivaikutuksesta.
Kaffeiinikäsittelyllä on samanlaista vaikutusta säteilytettyihin
HeLa-soluihin, joissa se blokeerasi RPA muodostumisen ja
Rad51-fokukset, jotka riippuvat 5´- 3´-resektiosta, trimmauksesta,
katkenneissa kromosomipäädyissä. Löydöistä tulee oivallusta
kaffeiinin käyttöön DNA-vaurion++ herkistävänä agenssina
syöpäsoluissa.
- I response to chromosomal double-strand breaks (DSBs), eukaryoticcells activate the DNA damage checkpoint, which is orchestrated by the PI3 kinase-like protein kinases ATR and ATM (Mec1 and Tel1 in budding yeast). Following DSB formation, Mec1 and Tel1 phosphorylate histone H2A on serine 129 (known as γ-H2AX). We used caffeine to inhibit the checkpoint kinases after DSB induction. We show that prolonged phosphorylation of H2A-S129 does not require continuous Mec1 and Tel1 activity. Unexpectedly, caffeine treatment impaired homologous recombination by inhibiting 5′ to 3′ end resection, independent of Mec1 and Tel1 inhibition. Caffeine treatment led to the rapid loss, by proteasomal degradation, of both Sae2, a nuclease that plays a role in early steps of resection, and Dna2, a nuclease that facilitates one of two extensive resection pathways. Sae2's instability is evident in the absence of DNA damage. A similar loss is seen when protein synthesis is inhibited by cycloheximide. Caffeine treatment had similar effects on irradiated HeLa cells, blocking the formation of RPA and Rad51 foci that depend on 5′ to 3′ resection of broken chromosome ends. Our findings provide insight toward the use of caffeine as a DNA damage-sensitizing agent in cancer cells.
Issue Section:
Johdannon suomennosta
INTRODUCTION
DNA kaksoiskatkokset ovat hyvin vahingollisia
tapahtumia, jotka voivat johtaa kromosomipoikkevuuksiin,
solukuolemaan ja syöpään. Kromosomikatokejn korjaus tapahtuu
useilla hyvin konservoiduilla teillä. G1 faasin solut ensisijaisesti
korjaavat kaksoiskatkon liittämällä uudelleen katkenneet päät
ei-homologisella päätteitten liitännällä (NHEJ) . Kun solut ovat
ohittaneet “starttikohdan” matkallaan S-faasin alkuun,
korjauksen päätie vaihtuu homologiseksi rekombinaatioksi HR.
Aloitusvaihe ja olennainen askel HR-tiessä on dsDNA:n 5´-
3´-resektio kaksoiskatkon päädyissä, trimmaus, mistä jää trimmattuna
jäljelle yksisäikeisiä 3´ päätyjä (ssDNA) Näyttö sekä in
vivo että in vitro viittaa siihen, että resektioN alkaa
MRX-kompleksi Mre11-Rad50-Xrs2 yhdessä Sae2 nukleaasin kanssa;
kasvavassa hiivassa homologi on CtIP.
Sae2 on havaittu in vitro-tutkimuksessa
nopeuttamassa 5´- 3´ resektiota edistämällä Mre11:n
endonukleaasiaktiivisuutta, vaikka oletetaan Sae2:lla itsellään
olevan nukleaasiaktiivisuutta. Laajempi resektio riippuu kahdesta
eri nukleaasiaktiivisuudesta: toinen käsittää Exo1 ja toinen
osallistuva on kompleksi, jossa on Dna2, Sgs1, Top3 ja
Rmi1.YksisäikeiEnn DNA-häntä, joka muodostuu resektiolla on ensin
replikaatioproteiini A:n peittämä (RPA) ja se tekee interaktion
Rad52:n kanssa nopeuttaen Rad51-rekombinaatioproteiinifilamentin
muodostumista. Rad51- filamentti katalysoi ssDNA:lle homologisten
sekvenssien etsintää läpi genomin ja edistää säikeen
invasoitumista ssDNA:n ja homologisen dsDNA:n välissä.
Säieinvaasiota seuraa DNA-synteesin aloitus invAsoituvan säikeen
3´-päädystä ja mahdollisesti DSB korjaantuu.
- DNA double strand breaks (DSBs) are highly deleterious events that may lead to chromosomal abnormalities, cell death and cancer. Repair of chromosome breaks occurs by several highly conserved pathways. G1 cells predominantly repair DSBs by re-joining the broken ends through nonhomologous end-joining (NHEJ) pathways (1,2). After the cells pass ‘start’ on their way to initiate S phase, the main pathway of repair shifts to homologous recombination (HR) (2–4). An initial and essential step in HR is the 5′ to 3′ resection of the dsDNA at the DSB end, which leaves 3′ single-stranded DNA (ssDNA) tails. Both in vivo and in vitro evidence suggests that resection is initiated by the Mre11-Rad50-Xrs2 complex (MRX) together with Sae2, the budding yeast homolog of CtIP (5–8). Recently, Sae2 has been shown in vitro to facilitate 5′ to 3′ resection by promoting the endonuclease activity of Mre11 (9), although Sae2 itself has been suggested to have nuclease activity (10). More extensive resection depends on two separate nuclease activities, one involving Exo1 and another involving a complex containing Dna2, Sgs1, Top3 and Rmi1 (6,7,11,12). The ssDNA tail created by resection is first coated by replication protein A (RPA) that interacts with Rad52 to facilitate the formation of a filament of the Rad51 recombination protein (13–15). The Rad51 filament catalyzes a search throughout the genome for sequences homologous to the ssDNA within the filament and promotes strand invasion between the ssDNA and homologous double-stranded DNA (dsDNA). Strand invasion is followed by the initiation of DNA synthesis from the 3′ end of the invading strand and eventual repair of the DSB (16,17).
Kun tapahtuu kaksoiskatko (DSB) sekvensseissä,
joilla on molemmissä katkospäädyissä homologiaa templaatin
sekvenssin kanssa (sisarkromatidi, jokin homologi kromosomi tai
ektooppinen donori), korjaantuminen tapahtuu geenikonversiolla (GC).
Jos vain toinen pääty kykeenee pariutumaan homologisiin
sekvensseihin, korjaantuminen ediStyy rekombinaatiosta riippuvalla
prosessilla, joka on katkoksen indusoimaa replikaatiota (BIR).
Korjaantuminen voi tapahtua myös Rad51:stä riippumattomalla tavalla
myöstäämällä yksittäistä DNA-säiettä (SSA, single strands
annealing), jos on kaksoiskatkoksen sivuilla homologisia
sekvenssejä.
- When the DSB occurs in sequences that share homology on both ends of the break with a template sequence (a sister chromatid, a homologous chromosome or an ectopic donor) repair occurs by gene conversion (GC). If only one end of the DSB is capable of pairing with homologous sequences, repair proceeds by a recombination-dependent process termed break-induced replication (BIR) (18,19). Repair can also occur in a Rad51-independent fashion by single-strand annealing (SSA) when there are homologous sequences flanking a DSB (20).
Jotta korjaantumiseen saa riittävästi aikaa ja
mitoosi estyisi murtuneen kromosomin läsnäollessa, solut aktivoivat
DNA-vaurion tarkistuskohdan. Kaksi tarkistuskohdan PI3-kinaasin
kaltaista proteiinikinaasia ,ATM ja ATR (Tel1 ja Mec1 hiivassa)
rekrytoituvat kaksoiskatkoon (DSB) ja fosforyloivat alavirran
effektorien kaskadin, mikä estää soluja jakaantumasta kunnes
vaurio on korjattu. Silmukoivassa hiivassa tukiproteiini Rad9
rekrytoituu kaksoiskatkoon ja siinä fosforyloituu Mec1:n toimesta.
Rad9 välittää sitten Rad53 (Chk2) ja Chk1-proteiinien
autofosforyloitumisen. Rad9 fosforyloi Cdc20 ja inhiboi sen (APC-aktivaattorin, anafaasia edistävän kompleksin aktivaattorin)
Tämä inhibitio Chk1:n aktivaation ohella stabilisoi Pds1:n, sekuriinin,
ja estää mitoosin. Kun korjaus on tehty valmiiksi, DNA-vaurion
tarkistuskohta menee off-tilaan ja sallii solujen ryhtyä jälleen
solusyklin progressioon ja tämä on toipumista, recovery. Jos
vauriota ei pystytä korjaamaan, solut voivat mahdollisesti asettaa
tarkistuskohdan OFF- tilaan adaptaatioprosessillla.
- In order to allow sufficient time for repair, and to prevent mitosis in the presence of a broken chromosome, cells activate the DNA damage checkpoint. Two checkpoint PI3 kinase-like protein kinases, ATM and ATR (Tel1 and Mec1 in yeast, respectively), are recruited to the DSB and phosphorylate a cascade of downstream effectors that, in turn, prevent the cells from dividing until the damage is repaired (21–24). In budding yeast, the scaffolding protein Rad9 is recruited to the DSB, where it is phosphorylated by Mec1 (24). Rad9 then mediates the autophosphorylation of Rad53 (Chk2) and Chk1 (22,25). Rad53 phosphorylates and inhibits Cdc20, an activator of the anaphase-promoting complex. This inhibition, along with activation of Chk1, stabilizes Pds1 (securin) and prevents mitosis (22,26). After repair is complete, the DNA damage checkpoint is turned off to allow the cells to resume cell cycle progression, a process termed recovery. If the damage cannot be repaired, the cells can eventually turn off the checkpoint by a process termed adaptation (27,28).
Toinen Mec1 ja
Tel1-kinaasien aktiivisuuden kohde on histonin H2Aseriini129. Tämä
modifikaatio, gamma-H2AX on evolutionaalisesti konservoitunut. ATM ja
ATR voivat nopeasti fosforyloida imettäväisen HsAX-S139 seriinin
vasteena DNA-vaurioon. Modifikaatio leviää 100 kb:n mitan
DSB-vaurion ympärillä hiivasoluissa ja 1Mb imettäväissolun
DSB-vaurion ympärillä ja se toimii korjaustekijöiden
rekrytoimisessa DSB.vaurion läheisyyteen. Jos soluista puuttuu kyky
fosforyloida H2A-S129 (H2A-S129A), ne adaptoituvat luonnollista
solua nopeammin, mikä viittaa siihen, että tällä modifikaatiolla
on merkitystä jarruttuman keston pituudelle. Yllättävää kyllä
on että histonia H2A-S129A ilmentävät histonit omaavat 5´-3´-
resektiotahdin DSB-päädyissä , mikä on suurempi kuin
luonnonsoluissa (6,8 kb/h versus 4 kb/h), mikä viittaa taas siihen
että enempi ssDNA tai resektiosivutuotteiden määrä ei sinänsä
tai itsestään signaloi tarkistuskohdan ylläpitoa. Gamma-H2AX
hiivassa on nopeasti poistunut korjaukseen jälkeen kromatiinista
vielä tuntemattoman faktorin toimesta ja sitten defosforyloituu PP4
fosfataasikompleksilla.
- Another target of Mec1 and Tel1 kinase activity is serine 129 of histone H2A. This modification, termed γ-H2AX, is evolutionarily conserved; ATM and ATR rapidly phosphorylate mammalian H2AX-S139 in response to DNA damage (29–32). The modification spreads as far as 100 kb around the DSB in yeast cells, and 1 Mb around a DSB in mammalian cells, and serves to recruit repair factors to the vicinity of the DSB (29,31,33). Cells that lack the ability to phosphorylate H2A-S129 (H2A-S129A) adapt faster than WT cells, suggesting this modification plays a role in determining the length hiivaof arrest (34,35). Surprisingly, cells expressing histone H2A-S129A have a rate of 5′ to 3′ resection of the DSB ends greater than that in WT cells (6.8 kb/h versus 4 kb/h), which implies that having more ssDNA or more resection byproducts does not, in and of itself, signal for checkpoint maintenance (36,37). γ-H2AX in yeast is rapidly removed from chromatin after repair by a yet unknown factor and then dephosphorylated by the PP4 phosphatase complex (38).
Kysymys on, onko Mec1 ja Tel1 konstitutiivisesti
vaadittu pitämään yllä gamma-H2AX:ta sen muodostumisen jälkeen.
Tutkijat käyttivät kaffeiinia estämään Mec1 ja Tel1 nukleaasit
sen jälkeen kun gamma-H2AX oli muodostunut. Kaffeiini toimi
PI3K-inhibiittorina ja sen on osoitettu inhiboivan ATM ja ATR
imettäväissoluissa ja kahdessa hiivassa.Tutkijat havaitsivat,että
gamma-H2AX jää pysyttelemään DSB:n ympärillä
kaffeiinikäsittelyn jälkeen, mikä viittaa siihen, että
modifikaatio on stabiili eikä riipu jatkuvasta
Mec1/Tel1-aktiivisuudesta.
- Here we asked if Mec1 and Tel1 are constitutively required to maintain γ-H2AX after its formation. We used caffeine to inhibit Mec1 and Tel1 after the formation of γ-H2AX. Caffeine acts as a PI3K inhibitor and has been shown to inhibit ATM and ATR in mammalian cells, Schizosacchromyces pombe and Saccharomyces cerevisiae (39–45). We find that γ-H2AX is retained around a DSB after caffeine treatment indicating that the modification is stable, and does not depend on continuous Mec1/Tel1 activity.
Imettäväissoluissa tuumorisuppressori p53
aktivoituu DNA-vaurion jälkeen G1 faasissa ja pitää yllä vahvaa
G1-tarkistuskohtaa. Päinvastoin S-faasin ja G2/M- tarkistuskohta
ovat täysin riippuvaisia ATM:stä ja ATR:stä, eivätkä tarvitse
p53:a. Todellakin kaffeiinikäsittely osoittautui sensitoivan p53-
vajeiset tuumorisolut jonisoivalle säteilylle.Tämän vaikutuksen
oletettiin tapahtuvan kaffeiinivälitteisein G2/M-tarkistuskohdan
eston takia. Kuitenkaan kaffeiini ei pystynyt enempää
säteilyherkistämään imettäväis- tai DT-40-soluja, joista HR
puuttui- tämä viittaisi siihen, että herkistysmekanismi
käsittäisi pikemminkin HR-inhibition kuin tarkistuskohdan
kontrollin inhibition. Tuore tutkimus osoitti, että
kaffeiinilla käsittely osallistui imettäväisten Rad51- välitteisen
linkkimolekyylin muodostamiseen in vitro ja geenikohdennuksessa in
vivo.
- In mammalian cells, the tumor suppressor p53 becomes active following DNA damage in the G1 phase, and maintains a robust G1 checkpoint (46). In contrast, the S phase and G2/M checkpoints are completely dependent on ATM and ATR, and do not require p53 (46). Indeed, caffeine treatment was shown to sensitize p53-deficient tumor cells to ionizing irradiation. This effect was hypothesized to occur due to the caffeine-mediated inhibition of the G2/M checkpoint (47–49). However, caffeine could not further radiosensitize both mammalian and DT-40 cells that are deficient for HR, suggesting that the mechanism of sensitization involves inhibition of HR rather than checkpoint control (50–52). A recent study showed that caffeine treatment interferes with mammalian Rad51-mediated joint molecule formation in vitro as well as gene targeting in vivo (53).
Tässä
tutkijat osoittivat, että kaffeiini heikentää kasvassa hiivassa
ja Hela soluissa resektiota (trimmausta) . He osoittivat kasvavalla hiivalla, että
HR-inhibitiota tapahtuu riippumatta DNA-vauriotarkistuskohdan
inhibitiosta korjauksen ensimmäiseen vaiheeseen puuttumalla.
Resektion (trimmauksen) huonontuminen korreloi Sae2 ja Dna2
nukleaasien runsauden vähentymään kaffeiinikäsitelyn jälkeen.
Tutkijat osoittavat, että molemmat nukleaasit kohdentuvat
proteosomisilppuriin hajoittumaan. Erityissti he osoittavat, että
Sae2 on epävakaa proteiini, koska se hajoaa nopeasti kaffeiinista
tai sykloheximidistä (CHX)- silloinkin kun DNA-vauriota ei ole.
Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen,
että kaffeiinikäsittely kohdentaa homologisen rekombinaation (HR) varhaisimpiin vaiheisiin riippumatta sen ATM/ATR-inhibitiosta.
että kaffeiinikäsittely kohdentaa homologisen rekombinaation (HR) varhaisimpiin vaiheisiin riippumatta sen ATM/ATR-inhibitiosta.
- Here we show that caffeine treatment impairs resection in budding yeast and HeLa cells. We show in budding yeast that inhibition of homologous recombination occurs independently of inhibition of the DNA damage checkpoint, by interfering with the first step in repair: resection of the DSB ends. The impairment of resection correlates with a reduction in the abundance of both Sae2 and Dna2 following caffeine treatment. We show that both nucleases are targeted for proteasomal degradation. In particular, we show that Sae2 is an unstable protein, as it is degraded rapidly following caffeine or cycloheximide (CHX) treatment even in the absence of DNA damage. Taken together, these data suggest that caffeine treatment targets one of the earliest steps in HR, independent of its inhibition of ATM/ATR.
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar