DNA repair , Genomin DNA.n korjautuminen

DNA repair (Per Arne Aasin väitöskirjasta muistiin  suomentaen  , 2004)

Tutkija mainitsee DNA:n korjaantumismekanismeista, jota on 5 eri ryhmää:

1. ”Direct reversal”-, jossa yksi entsyymi korjaa vaurion ilman DNA-synteesiä.

2. Base excision repair (BER) ( base, pelkkä puriini-tai pyrimidiiniemäs)

3. Nucleotide excision repair (NER)

4. Mismatch repair (MMR)

5. Recombination repair (RR) ( mainitaan )

Eri korjaustiet korjaavat lähinnä eri luokkien DNA-leesioita.

Osa järjestelmistä toimii ”overlapping”toisen järjestelmän kanssa.

ja täten ne voivat antaa taustatukea toisilleen ( back up).

Edellisten lisäksi on olemassa solun damage tolerance eli

vaurionsietojärjestelmä, johon kuuluu erilaisia polymeraaseja ja ne voivat sallia joidenkin DNA-vaurioiden olemisen läpi replikaation.

 Nämä polymeraasit voivat olla osallisena ”lesion bypass”- järjestelmässä,- vaurion ohittamisen prosessissa, jota kutsutaan nimellä ” translesion synthesis”(TLS). Täten tulee kuin merkki: “Tämä kohta on virheellinen ja tätä ei toisteta vaan ohitetaan”. TLS voi olla ”error prone” tai ”error free” polymeraasista riippuen.

 

1. Direct reversal of DNA damage

Tunnetaan neljä eri DNA-vaurion suorakorjausjärjestelmää.

1.1.Photolyase , fotolyaasientsyymi

korjaa UV-säteilyn aiheuttaman vaurion cis-syn-pyrimidiinidimeerissä valosta riippuvassa reaktiossa. Tämä korjaus tapahtuu bakteerilla, mutta ei ihmisellä

1.2. DNA ligaasi

korjaa yksinkertaisen DNA mutkan.

Ihmissoluissa on useita DNA-ligaaseja, joilla on erilaisia tehtäviä DNA korjauksessa taikka replikatiossa.

Polymeraasi beetta on interaktiossa DNA-ligaasi I:n kanssa suoraan ja epäsuoraan taas XRCC1:n välityksellä . (1996).

DNA-ligaasi III alfa muodostaa stabiilin kompleksin XRCC1:n kanssa ja on interaktiossa PARP1 ja PARP2:n kanssa.

Nämä molemmat proteiinit ovat interaktiossa keskenään ja polymeraasi beetan kanssa ja samalla tekevät linkin DNA ligaasi IIIalfan ja Base excision repair (BER)- ja single -strand break repair- mekanismeihin, koska XRCC1 ja PARP ovat jälkimmäisessä osallisia.

Suurin osa short patch repair- tapahtumista saadaan täydellisesti suoritetuksi DNAligaasi IIIalfa/XRCC1- kompleksilla.

DNA-ligaasi IIIalfa ei ole assosioitunut replikaatiofokuksiin eikä ole BER:ssä mukana , jos se tapahtuu lähellä replikaatiohaarukkaa.

1.3.   Metyylin poistajat, MGMT, O-metylguanine-DNA-methyltransferase

Tämä entsyymi siirtää metyylin tai muun yksinkertaisen alkyyliryhmän O6-alkyyliguaniinista tai O4-alkyylithymiinistä omaan cysteiniinsä, jolloin entsyymi itse inaktivoituu vapauttaessaan nukleotidin. Tämä entsyymi luo soluissa resistenssiä Guaniinia O6-alkyloivien aineitten sytotoksisuutta vastaan. (Toisaalta solut voidaan tehdä herkiksi alkylaatiolle alentamalla tämän MGMT-entsyymin vaikutusta).

Jos O6-mG ei korjaannu, seuraa ”mismatch” thymiiniin päin (T) ja silloin mismatch repair ( MMR)- systeemi triggeröityy ja apoptoosi voi seurata. 

1.4.     Alkyylin irrottajat AlkB, hABH12, hABH3 ( human AlkB homologue)

Alkyloitunut DNA voi korjautua siten, että alkyyli voidaan saada irrotettua.

Alfa-KG:sta ja raudasta riippuva oxygenaasi hydroxyloi DNA-emäksen alkyyliryhmän, jolloin alfa-KG muuttuu meripihkahapoksi ja alfa-KG:n C5 irtoaa hiilidioksidina  Hydroksyloitu metyyli vapautuu spontaanisti formaldehydinä

Tällä korjauksella irtoaisi CH3- ryhmä 1-meA.sta tai 3-meC.stä korjaten adeniinin ja cytosiinin DNA.ssa ja RNA.ssa. Tekijää tai entsyymiä sanotaan AlkB (DNA and RNA), tai hABH12 (DNA) tai hABH3 (DNA and RNA).

Tämä tutkimus esitti kaavan näiden ”human Alk B homologue ” oletetusta reaktiosta..

2    BER, DNA repair mechanism . Base excision repair (BER)  Pääjärjestelmä virheellisen emäksen korjaamiseksi.

”The main Guardian” against DNA damage.

Pääsuojelujärjestelmä DNA-vauriota vastaan tapauksissa, joissa vaurion on aiheuttanut DNA:n ja soluaineenvaihdunnan periytynyt instabiliteetti, myös ROS ( vapaitten radikaalien), metylatioitten, deaminatioitten ja hydroksylatioitten aiheuttamat instabiliteetit ( epävakaudet). Luettelona tavallisimmista emäsvauriotyypeistä on ensin seuraavat esimerkit: 

Adeniini (A) (puriinirakenne):

Deaminaatio hypoxantiiniksi,

Oxidaatio 8-oxoadeniiniksi ja 4,6-diamino-5-formamidopyrimidiiniksi. 

Alkylaatio 1-meA, 3-meA, 7-meA,1,N6-ethenoadeniiniksi.

Thymiini (T) (pyrimidiinirakenne):

Oxidatio thymiiniglycoliksi,

Alkylaatio 3-metyylitymiiniksi ja

 UV-vaikutus cyklobutaanitymiinidimeeriksi.

Cytosiini (C ) (pyrimidiinirakenne):

Deaminatio urasiiliksi (U), 

Oxidatio 5-hydroksicytosiiniksi,

 Alkylaatio 3- metyylicytosiiniksi.(3-meC)

5- metyylisytosiinin (5-meC) deaminaatio tymiiniksi (T).

Guaniini (G) (puriinirakenne):

Deaminaatio xantiiniksi, 

 Oxidaatio 8-oxoguaniiniksi ja 2,6-diamino-4-hydroksi-5-formamidopyrimidiiniksi.

Alkylaatio N2-metyyliguaniiniksi, 3-metyyliguaniiniksi,

1,N2-etenoguaniiniksi tai 7-metyyliguaniiniksi.

Tämä yksittäisen emäksen poistojärjestelmä (BER) poistaa päivittäin yli 10 000 DNA leesiota ihmissolusta (1993). Erilaiset DNA-Glykosylaasit aloittavat tämän mekanismin pilkkomalla N-glykosidisen sillan emäksen ja desoksyriboosin väliltä, jolloin muodostuu AP-paikka, apuriini tai apyrimidiini-kohta (AP-site).

Joka glykosylaasi on kapeaspektrinen, mutta toimii kuitenkin overlapping. Ihmisglykosylaaseilla on N–terminaalinen sekvenssi, joka auttaa lokalisoitumisessa ja interaktioissa. DNA-glykosylaasien tehtävänä on havaita ja poistaa sopimaton tai viallinen emäs. Se tehdään flipping- menetelmällä, jossa irronut emäs tiputetaan glykoosientsyymitaskuun tai onteloon. Jos emäs sopii siihen onteloon, se hydrolysoidaan irti N-glykosidisidoksesta emäksen ja desoxyriboosin välikohdasta.

DNA-glykosylaasit voidaan jakaa kahteen pääryhmään:

a) Monofunktionaaliset DNA-glykosylaasit

hydroksylaasit (, jotka käyttävät aktiivia vesimolekyyliä tehden vapaan AP-site , abasic site) AP-kohdan , johon asettuu endonukleaasi APE1.

5´-fosfodiestrisidos katkeaa sitten tällä Mg++:sta riippuvalla AP-_endonukleaasilla, jolloin jää 3´-hydroksyyli ja 5´desoksyribofosfaatti (dRP) terminaali. (APE1stimuloi Pol-beettaa excidoimaan 5´-terminaalisen dRfosfaatin). Tämä pieni bifunktionaalinen polymeraasi Pol beetta, jolla on lyaasiaktiivisuutta, poistaa abaasisen tähteen ja kiinnittää oikean yksittäisen emäksen. Leesiot, jotka leikataan, excidoidaan, tällä monofunktionaalisella DNA- glykosylaasilla korjataan short tai long patch pathway- tien avulla.

ja b) Bifunktionaaliset DNA-glykosylaasit

käyttävät veden sijasta aktiivikohdan amininukleofiiliä. Eliminaatioreaktiossa lähtee myös abaasisen nukleotidin 3´-fosfaattikin irti.

Tällainen beetta-lyaasiaktiviteetti glykosylaasissa antaa olettaa, että seuraavan korjausaskeleen suorittaa polymeraasit eikä lyaasit.

(Leesiot jotka leikataan irti, excidoidaan, tällä glykosylaasilla, korjataan short patch- tietä)

BER -funktiossa on korjausvaiheessa erotettavissa kahta erilaista edellä mainittua tietä: long patch pathway ja short patch pathway.

Tien valinta tapahtuu DNA-vaurion laadun, glykosylaasityypin, DNA-polymeraasityypin (beetta, deltta, epsilon) ja mahdollisesti solusyklivaiheen perusteella.

Short patch pathway, yksittäinen emäs korjataan

In vivo on short patch- tie prevalentein ja siinä tapahtuu yksittäisen nukleotidin uudelleen sijoittaminen.

Long patch pathway,

kahden tai useamman emäksen pätkää käytetään, ”flap”.

Long patch -BER käsittää useamman nukleotidin, 2- 8 kappaleen, korvaamista, Tämä tarkoittaa, että 3´-kohtaan lisäytyy useampia nukleotidejä, ” flap”, joka sitten otetaan endonukleaasilla irti

Entsyymin nimi on flap endonukleaasi1 (FEN1). Tämä pitempi paikkaus voi olla aiheellinen, jos AP-kohta, abaasinen kohta, on vaurioitunut siten, että Pol beetta- lyaasientsyymi ei pääse toimimaan, kun kohta ei ole sen lyaasiaktiivisuuden vaatima substraatti.

APE1 entsyymin tehtävä,  AP endonukleaasi.

Abaasinen kohta sinänsä merkitsee sytotoksista ja mutageenista kohtaa. Arvellaan, että glykosylaasi jää tähän abaasiseen kohtaan sen jälkeen, kun emäs on irti ja entsyymi APE1 ottaa sen sitten pois siitä. Näitä on kaksi ihmisellä APE1 ja APE2, AP- endonukleaaseja, runsaita proteiineja, esim solussa voi olla 350 000-7 miljoonaa molekyyliä tätä APE1-proteiinia. Sitä kertyy esim DNA-mutkiin ja se kiihdyttää polymeraasi betaa ja edistää yksittäisen nukleotidin asianmukaista korjautumista. (Herää kysymys: miten paljon DNA tarvitsee hyvää proteiinisynteesiä korjantuakseen???/lb)

XRCCI

Mainitaan vielä proteiini XRCC1 tässä BER-järjestelmässä. Sillä on jokin keskeinen ko-ordinoiva osuus BER- järjestelmän entsyymien aktiivisuudessa, koska asiaan kuuluu laajat interaktiot. Jos tämä XRCC1 -funktio puuttuu, solut ovat hypersensitiivisä jonisoivalle säteilylle, oxidoiville tekijöille ja alkyloivlle agensseille ja niissä on myös enemmän kromosomiaberraatioita ja deleetioita (2000). XRCC1- proteiinin rakennetta ei tunneta (2004), mutta sen N-terminaali on interaktiossa polymeraasi beetan kanssa ja sen kaksi BRCT-domaania välittää interaktiota PARP-proteiineihin( poly(ADP-riboosi)polymeraaseihin) ja DNA-ligaasi III:een (2004)

PARP1 , poly(ADP-riboosi)polymeraasi

on proteiini jota on runsaasti tumassa ja se löytää DNA-juovan rikkoutumia.

Jos tämä proteiini puuttuu, genotoksisten tekijäin sieto alenee ja tulee vaikeita defektejä DNA:n korjausmekanismiin.

Long patch- pathway BER- mekanismissa vaikuttaa olevan myös replikaatioon assosioitunutta.

“Knock out” sellaisille tekijöille BER – funktiossa kuten APE1, XRCC1 ja Pol beetta, ovat embryolle letaaleja. Jos Pol beetta puuttuu, koe-eläin ei elä postnataalisti. Myös PARP1 ja PARP2 puutteessa esiintyy embryonaalinen letaalius. Kyse on siis proteiineista, joita täytyy vitaalisti olla olemassa

3.   NER - DNA REPAIR MECHANISM  Nucleotide Excision Repair (NER)

Ei ole niin yksinkertainen kuin BER Base excision repair.  NER- mekanismiin kuuluu noin 30 aktiivia proteiinia ja siinä tapahtuu “single stranded excision repair patch”, mikä täytetään DNA-synteesillä ja ligaaseilla (1999)

NER tapahtuu neljällä vaiheella:

(1) Vaurion tunnistus, 

(2) dual incision, vauriopalan poistoleikkaus

 (3) aukon täyttö,

 (4) loppusilauksena ligeeraus ligaaseilla

NER prosessissa mennään kahta reittiä:

(a) Global Genome repair (GG-NER).

( b) Transcription coupled repair (TC-NER).

Tämä (b) on nopeampi, vaatii RNA-polymeraasi II-läsnäoloa korjauksen kohteessa ja ne kohdat joita käytetään genomista useimmin, korjautuvat nopeimmin.

NER- defektit vastaavat ainakin kolmesta harvinaisesta eri geneettisestä häiriötilasta XP, CS ja TTD:

Näitä NER- prosessin proteiineja alettiin havaita, kun tutkittiin niitä sairaustiloja, mitä NER funktion poisjääminen aiheuttaa.

XP on xeroderma pigmentosum, autosomaali resessiivinen häiriö, jossa on alttius ihosyöpiin, lähinnä levyepiteeli-ja basaalisolukarsinoomaan sekä erääseen melanoomatyyppiin.

XP voidaan jakaa moniin komplementaatioryhmiin, sen mukaan mitä kykyjä soluilla on täydentää toisiaan fuusiokokeissa. Löydettin 8 eri ryhmää XPA, XPB, XBC, XPD, XPE, XPF, XPG sekä XPV

( variantti) (2001)

XPV: Näillä potilailla on alttius ihosyöpään eikä heillä tapahdu UV-vaurion jälkeen ”accurate replication bypass”. XP-V geeni koodaa Bypass DNA polymeraasia.

CS on Cockayne syndrome. Nämä potilat ovat UV-herkkiä, mutta he eivät ole alttiita saamaan ihosyöpää. Heillä GG-NER toimii normaalisti, mutta TC-NER on puutteellinen. Heillä on normaalitranskriptiotekijöitä CSA ja CSB koodaavassa geenissä mutaatioita

On löydetty potilaita, joilla on kombinoitu XP&CS syndrooma. Heillä on mutaatioita XPB, XPD tai XPG- peptideissä.

TTD on tricothiodystrophia: Siinä on havaittu mutaatioita XPD ja XPB peptideissä. TTD potilaat ovat herkkiä UV:lle, mutta eivät alttiitta saamaan ihosyöpää. Heillä on pirstoilevat hiukset ja kynnet ja rikkipitoisten proteiinien vajaus kudoksissa. Monia fyysisiä poikkeavuuksia, retardaatiota ja suomuilevaa ihoa kuuluu oireisiin. Useimmilla TTD-potilailla NER- funktio on defektiivinen.

Fenotyyppiero syöpäalttiudessa XP- ja CS -sekä TTD- potilailla on se, että TC-NER CS-taudissa ja TTD-taudissa NER triggeröi apoptoosin.

(1) Vauriokohdan tunnistus

Vähiten tunnetaan GG-NER -prosessin sitä osaa, joka voi tunnistaa nukkuvan G0 solun DNA-vaurion. TC-NER-prosessissa tämä on helpommin selitettävissä: RNA-polymeraasi II- arrest- pysähtymä pulleassa (bulky) leesiossa on signaali, josta seuraa DNA-korjaustekijöiden kutsuminen paikalle (2001). Transkriptio ja sen jälkeinen kromatiinin ”remodelling” saattaa passiivisti tarjota NER-tekijöille pääsyä paikalle.

Transkriptioblokin havaitseminen vahvistaa globaalileesion havaitsemista tuloksena siitä, että p53 on relaksoinut kromatiinin histoniasetylaatiolla (2003). Tunnetaan muutama proteiini, jota tarvitaan leesioon sitoutumisen alkuaskeleissa: XPC, heterodimeerinen RPA & XPA. XPC kiinnittyy DNA:han, jossa on emäsleesiö, joka on NER-substraatti. XPC ja hRAD23B ovat tiivis kompleksi. Se vastaa yhdeltä osalta (1) vauriopaikan tunnistamisesta GG-NER-proseduurissa.Mutta

XCP ei ole tarpeen TC-NER-proseduurissa. Sen sijaan puute CSA ja CSB proteiineissa aiheuttaa TC-NER funktion vajeen.

Muilta prosessiaskelilta GG-NER ja TC-NER jatkuvat samalla tavalla.

XPA sitoutuu monenlaiseen DNA:han ja RPA sitoutuu ehjään DNA:han, kun XPC & hRAD23 ovat sioutuneet.

Kun vaurio on paikallistettu, osallistuvat NER-faktorit spesifisesti.askeleittain. “The core transcription factor IIH” (TFIIH), jolla on 6 alayksikköä, on seuraavana komponenttina. Se on osa RNA polymeraasi lI:n basaalista transkriptiokompleksista, joka vaaditaan transcription initiaatioon ( aloitukseen).

TFIIH:n kaksi alayksikköä, XPB ja XPG ovat DNA-helikaaseja, jotka suoristavat DNA:ta transcription ja NER-proseduurin aikana.

TFIIH luo pullean muodostuman, jossa on epämääräinen liittymä dsDNA:n ja ssDNA:n välillä. Tämä muodostus on tärkeä, jotta

(2) kaksoisinkisiosta tulisi täsmällinen. dual incision,

(2) vauriokohdan poistaminen

Incision tekee endonukleaasit XPG ja heterodimeeri ERCC1-XPF. Nämä halkovat DNA 3´ ja 5´ leesioksi Fragmentin pituus riippuu emäsvaurion paikasta. Pätkä 24-30 nukleotidia irtoaa.

(3) aukon täyttö

”Gap”, välipaikka, joka muodostuu, täytetään DNA polymeraaseilla delta ja epsilon.

(4) raon umpeen ligeeraaminen

DNA ligaasi I ligeeraa umpeen muodostuneen raon

4    MMR , Mismatch repair,   DNA REPAIR MECHANISM. Väärin pariutuneen emäksen tai kromatidisilmukan korjaus.

Tämä järjestelmä voi poistaa yksittäisen emäksen, joka on väärin pariutunut vastakkaisen emäksen suhteen tai sitten se voi poistaa insertion-deleetio-silmukan, joka on muodostunut replikation aikana.

Korjaus tehdään aivan juuri syntyneeseen uuteen DNA-ketjuun. Soluilla on spesifinen mekanisminsa, jolla se voi havaita eron parentaalisen DNA:n ja vastasyntetisoidun DNA:n välillä

Bakteereilla arvellaan merkkinä toimivan metyloitumisasteen (1995). Vanhempi DNA on metyloituneempi. Metylaation puute taas on signaali strand selection- tapahtumalle Kolibakteerilla MutS homodimeeri tunnistaa virheen ja sitoutuu mismatch kohtaan. MutL homodimeeri kutsutaan paikalle ja sitten MutH tunnistaa ja pilkkoo fosfodiesterirungon metyloitumattomasta kohdasta lähellä olevalta dam kohdalta joka on hemimetyloitu. Sitten erotetaan emäkset dam kohdan ja mismatch kohdan väliltä ja resyntetisoidaan.

Eukaryoottisilla EI TUNNETA strand discrimination- mekanismia (2001), mutta se saattaa olla kontaktissa lähellä olevaan replikaatiojärjestelmään.

Jos ihmisellä on vajetta MMR- korjautumisissa, mutaatioitten määrä lisääntyy huomattavasti. Henkilöt ovat alttiimpia syövälle, lähinnä colon carsinoomalle, myös mahalaukun, endometriumin ja ovariumin syövälle (2003). Jos esiintyy itusolulinjan MMR-geenien mutaatioita, 80 %:lle näistä henkilöistä kehitty colon karsinooma (1996)

Näistä HNPCC tapauksista useimmilla on mutaatioita geeneissä MLH1 ja MSH2.

Ihmisellä on MMR- järjestelmässään tekijöitä hMutSa kompleksi

( heterodimeeri hMSH2 ja hMSH6).

Tämä kompleksi voi korjata pieniä silmukoita MMR- prosessin aikana.

Heterodimeeriset proteiinit hMutL-kaltaiset proteiinit( hMLH1, hPMS2, joka on hMutL alfa ) ,(hMLH1, hPMS1, joka on hMutL beta) ovat interaktiossa MSH kompleksien ja replikaatiotekijöitten kanssa. MSH omaa ATPaasi ominaisuutta, joka on essentielli mismatch repair- toiminnassa.

Joukko proteiineja osallistuu uuden, vaurioituneen DNA-rungon excisio ja resynteesitapahtumin.

Näitä ovat Pol d ja e; RPA, PCNA, RFC, exonukleaasi I ja endonukleaasi FENI.

MMR komponentit ovat myös interaktiossa rekombinaatioon ja NER tapahtumiin kuuluvien proteiinien kanssa. 

Apoptoottisesa tiessä mukana olevat tekijät C-Myc ja MAX omaavat interaktiota MSH2- tekijään. PMS2 omaa interaktiota p73:een päin ( p73 ja p63 ovat mukana apoptoosin induktiossa, jos syynä on DNA-vaurio vaikka p53 funktiota esiintyy). 

On todisteita siitä, että MMR- proteiinit ovat myös MEIOOSISSA mukana mis match –tilanteen korjauksissa.

Näitä ovat MutS, MSH4, MSH5,MutL, MLH1, MLH3, PMS2.

MSH2 on mukana seuraavassa: error free homologous recombination(HR)- tapahtumassa

( 2003)

MMR-proteiinit ovat mukana myös “chek point “-activaatioissa DNA vaurion jälkeen.

Tarvitaan tietty MSH2-pitoisuus, jotta G2/M checkpoint voi aktivoitua. 

Jonisoivan säteilyn jälkeen

tarvitaan MMR-systeemiä aktivoimaan S-faasi “check point”. Jos MLH1 ja MSH2 puuttuvat, vallitsee säteilyresistentti DNA-synteesi.

Jos MMR puuttuu, “check point” kinaasi CHK2 ei fosforyloidu eikä CDC25A hajoa.

 

Yllä on käsitelty yksinkertaisia vaurioita, entä jos on DNA:n molempien säikeiden vaurio?

• DOUBLE STRAND BREAK (DSB) REPAIR

Miten voi molempien vastaavien DNA-kromatidien samanaikainen vaurioituminen ylipäätänsä jotenkin korjaantua?

Kun solu havaitsee kaksoisvaurion DNA:ssa, monta kaskadia aktivoituu pysäyttämään solusyklin ja korjaustekijöitä alkaa kertyä paikalle:

ATM-kinaasi on kaskadien varhaisaloittaja.

Sen puute taas aiheuttaa progressiivisen neurodegeneraation, immuunivajauden, steriliteetin, ja kohonneen syöpäriskin.

ATM on hypersensitiivinen jonisoivalle säteilylle (IR), mutta sillä ei ole yliherkkyyttä UV-säteilylle. (ATM tulee sanoista, ataxia teleangiectasia mutated kinase). ATM ( dimeeri tai oligomeeri) aktivoituu fosforyloitumalla ja kromatidin muutos jo aktivoi sen (2003), ATM-funktion puutteessa -jos solu altistuu jonisoivalle säteilylle, onkin solusyklin G1/S-, S- ja G2/M- “chek point” kohtien aktivoituminen puutteellinen ja jää tapahtumatta. (radio resistant DNA synthesis phenotype).

On kyllä toinen kinaasi ATR,

joka osin voi toimia tässäkin, vaikka ATM puuttuu.

Kuitenkin p53 (genomin suojelijan) fosforylaatio ja stabilisaatio vaatii pääasiassa ATM , jos on jonisoiva säteily (IR) kyseessä, ja ATR tarvitaan p53- fosforylaatioon, kun on UV säteily kyseessä.

Kun jonisoiva säteily ( IR) aiheuttaa solusyklin pysähtymän, osallistuu seuraavia tekijöitä ATM-kinaasin substraatteina:

:p53, Mdm2, CHK2, (G1 checkpoint) (MMR tarvitaan myös)

NBS1, BRCA1, FANCD2, SMC1(S-faasin pysähtymä)

BRCA1, hRAD17 (G2/M checkpoint) (2003)

Toinen jättiproteiini aktivoituu kun on kaksoisvaurio DNA:ssa. Sen nimi on DNA-PK:

 

Tapahtuma, joka on riippuva ATM. ATR ja DNA-PK-aktivaatiosta, on

Histoni H2AX fosforylaatio megabaasietäisyydellä vauriosta sijaitsevassa domaanissa. Se kohta tarvitaan säteilyn vikuuttamien kohtien indusoimien essentiellien proteiinien kertymistilaksi, alustaksi, DSB vaurion lähistöllä- (vähän niinkuin hengenpelastus heikoilla jäillä tarvitsee myös tukevampaa, ”olevaista” alustaa avannon läheltä auttajille).

Lymfooma frekvenssi nousee, jos on DSB/repair puutos ja kromosomiaberraatio (Nijmegenbreakage syndrome, NBS)

Miten DNA katkeaa molemmista kromatideista?

DSB, DNA:n molemman ketjun samanaikainen vaurio tapahtuu lähinnä jonisoivan säteilyn (IR) aiheuttamana, vapaista radikaaleista (ROS), kemiallista vaikutuksista ja yksinkertaisen DNA-ketjun vaurion replikoitumisesta.

Arvellaan että solusyklin aikana kehittyy noin 50 tällaista DSB- vauriota. Tämä on ekvivalenttinen siihen lukuun, mitä heikosti jonisoivan säteilyn määrän 1.5-2.0 Gy (Gray yksikköä) sanotaan aiheuttavan ( 2003).

NHEJ ja HR

DSB- vauriot voivat korjaantua joko

“non-homologous end joining” (NHEJ)- menetelmällä tai yleisesti ottaen tarkempaa homologisen rekombinaation (HR) tietä käyttäen.

Ihmisen soluissa DSB -vaurion korjaus tapahtuu pääasiallisesti NHEJ-tietä. Kuitenkin HR ja NHEJ voivat kilpailla DSB-vaurion korjaamisesta (2003), erikoisesti myöhäisen DNA-synteesi (S) faasin ja G2- faasin rajakohdassa, kun sisarkromatidit ovat lähellä toisiaan: Tässä kohtaa on HR päämekanismina DSB-korjauksessa.

• NHEJ- menetelmä

Katkoskohdan päihin alkaa kertyä korjausproteiineja. NHEJ alkaa siten, että katkenneet DNA-päät kiinnittävät runsasta Ku70/Ku86 heterodimeeriä ja DNA-proteiinikinaasin (PK) katalyyttistä(c) alayksikköä(s) nimeltä DNA-PKcs. Tämä kinaasi aktivoituu, kun se kiinnittyy DNA-päihin ja fosforyloi proteiinin ARTEMIS.

DNA-PKcs ja ARTEMIS muodostavat kompleksin. Niin koeputkessa kuin kehossa tämä kompleksi toimii endonukleoosin tavoin ja trimmaa DNA-päät DSB-vauriokohdassa( poistaa 5´ ja trimmaa pitkät 3´ pätkät) ja on kykenevä irrottamaan

( pilkkomaan) DNA-pinnimuodostumat, joita VDJ-rekombinaatiossa tulee. Arvellaan, että polymeraasi täyttää gap- aukkoa NHEJ:n aikana, mutta ei tiedetä, mikä niistä ( template -dependent fill in synthesis). Arvellaan, että Polymeraasi u ( myy) on asialla. (2002). Kohdan sinetöi sitten XRCC4-DNA ligaasi-IV-kompleksi.

Ketjut ovat korjautuneet ( error prone).

Jos tämä ARTEMIS joutuu inaktivoivan mutaation kohteeksi, seuraa kliinisesti vaikea kombinoitu immuunipuutostila (SCID) ihmisessä. Koe-eläimessä todetaan vastaavaa tilaa jos DNA-PKcs on toimimaton. Fenotyyppi johtuu funktionaalisen VDJ rekombinaatiokyvyn puutteesta.

• HR (Homologous recombination)

Hiivasolussa tapahtuu DSB- kaksoisvaurion korjaaminen HR-menetelmällä päasiassa, kun on diploidi vaihe, NHEJ järjestelmä nähdään jossain hiivan haploidissa vaiheessa.

Multisellulaariset eukaryosyytit sen sijaan valitsevat kaksoisvaurion korjauksessa lähinnä NHEJ-menetelmän. Syynä on sekin, että HR näissä monisoluisissa eukaryosyyteissa on liian hidas prosessi ja voisi johtaa kromosomaalisiin translokaatioihin, koska niissä on laajempia DNA- toistojen homologisia fraktioita, mistä seuraa homologista cross over-reaktiota.

Koe-eläimellä HR-faktoreitten (RAD51, RAD51B, RAD51D, Xrcc2, Mre11, NBS1) puute voi johtaa embryoletaalisuuteen, poikkeuksena tekijät ATM, RAD52, RAD54. Tästä päätellään, että on HR funktio on tärkeä.

HR tapahtuma ( kuva) : RAD 50, Mre11, NBS1 kompleksi resekoi 5´-päät. RPA suojaa 3´-päät. RAD51 sitoutuu 3´-päihin.

RAD51, RAD 52 ja RAD 54 stimuloivat homologien etsintää ja haaran migratiota. Homologiset ketjut syntetisoituvat.

Ligaasi siloittaa korjautuman ja kromatidit erottautuvat. Ketjut ovat korjautuneet ( error-free).

• 5      RR- DNA REPAIR MECHANISM  Recombination repair (RR) Tästä ei tässä yhteydessä .

• TOLERANCE, BYPASS. DNA-korjausmekanismien lisäksi solulla on vaurion toleranssi ja ohitusmekanismi

By-pass of damage in human cells

Vaurion ohittaminen ihmissoluissa, TLS 

Polymeraasit pitävät yllä genomin integraatiota replikaation ja korjaamisten kuluessa. (alfa, beta, gamma, delta, epsilon polymeraasit).

On löydetty 10 uutta polymeraasia viimeksi kuluneiden 4 vuoden aikana (2004) . Telomeraasit ja terminaaliset transferaasit ovat joukossa. Polymeraaseja on nyt 19 ainakin. Ne jaetaan 4 eri perheeseen A, B, X ja Y-perheet.

Kun replikaatiokoneiston templaatti- ketjussa on tullut vaurio-ja blokkitilanne, replikaatiohaarukan progressio, eteneminen,  pysähtyy. Eri mekanismit koettavat ratkaista ongelmaa: rekombinaatio, vaurion ohitus haarukan regressiolla tai haarukan restauraatiolla, ohitus translesionaalilla synteesillä (TLS).

On olemassa viisi hiljattain havaittua transleesio-replikaatioentsyymiä ( neljä pol ja REV1). Kolme viimemainittua on superperheY-jäseniä.

Mitä funktioita eri DNA polymeraaseille oletetaan?

Mm seuraavaa tiedetään:

Pol alfa ( replication priming)

Pol beta ( osallistuu BER- tapahtumaan);

Pol gamma ( osallistuu BER- tapahtumaan);

Pol delta ( johtavan ketjun replikaatiossa, korjauksessa);

Pol epsilon ( vastapäisen ketjun replikaatiossa, korjauksessa, virheen sensorina);

Pol zeta ( TLS tapahtumassa , Ig hypermutaatiossa);

Pol eta ( TLS-tapahtumassa, sivuosaa Ig hypermutaatiossa) ;

Pol theta ( cross link -korjauksessa);

Pol iota ( TLS ja BER-tapahtumissa, myös tärkeä Ig hypermutaatiossa);

Pol kappa (TLS-tapahtumassa);

Pol lambda ( meioosissa, BER-tapahtumassa) ,

Pol myy ( dsDNA vaurion korjauksessa);

Pol sigma ( sisarkromatidikoheesiossa);

Pol phi ( rRNA);

REV1 ( TLS-tapahtumassa);

TdT ( Ig ja T-solureseptorien geenin diversiteetissä).