Ajatuksia Tymiinistä(T) ja Urasiilista (U). Per Arne Aasin väitöskirjasta: UNG ja muiksta korjausmenetelmiä

Löysin Per Arne Aasin väitöskirjan DNA.n korjausmekanismeista  vuonna 2004 ja käänsin itselleni suomalaista sisältöä  tästä vaikeasta ja uudesta asiasta.  Voi ollt käsitysvirheitä ja käännösvirheitä joukossa
. Täytyy päivittää sitä mukaa kun valkenee. 2004-12-15. Myös omia ajatuksia tässä ohella  tymiinin aineenvaihdunnasta. 14.10.2015.

Urasiilin poispoiminta DNA:sta

A-T, G-Covat Watson Crick- parit, joihin  U eivät  kuulu DNA:ssa 

 ( Vanhaa tietoa kertaan Harperin biokemiasta)

Puriini ja pyrimidiinirakenteitten aineenvaihdunnasta (Harper)  

voi löytää seikkoja, jotka heijastuvat jopa uusimpiin löytöihin DNA-ja RNA- materian tutkimuksissa. Vahva ”tippuminen”, ”vanheneminen”, urasiiliksi (U) päivittäin sytosiinista (C) käsin, on erityisen huomiotaherättävä seikka, sillä siinä on tapahtunut molekyylityypin  vaihtuminen DNA-emäksistä RNA- emäksiin keskellä DNA- materiaalia. Tämä taas rasittaa  korjausjärjestelmiä.

Epäsuora lisärasitus lie  sekin, että tymiini (T) on tavallaan ” kallis molekyyli”, arvokas lopputuotetila pyrimidiiniemästen anabolisessa rakentamisessa ( karbamylfosfaatti+aspartaatti; karbamylaspartaatti; dihydro-orotaatti; orotaatti; orotidylaatti; uridylaatti (UMP)- ja rekvisiittana sen muodostuksessa tarvitaan täyden varustuksen koentsyymit ja essentiellit vitamiinit, joista nyky-yhteiskunnassa ollaan kompromississa muutenkin. 

Cytosiininsynteesikartassa   tavataan mm muodot UMP; UDP; UTP + aminoryhmä, valmis CTP 

Tymidiinin kehittymisessä mm tavataan : UMP; UDP (reduktaasi); dUDP, dUMP (aktiivi metyyli, -CH3, B12, foolihappo; dTMP tymidylaatti, dTTP).

Jotta aineenvaihdunnan urasiilirakenteesta sen latauduttua fosfaateilla (UMP, UDP, UTP) voisi muodostua jälleen tymiiniä, vaaditaan kohtalaisen hyvä energiatila, tarpeeksi proteiinia ja proteiinilähteitten koentsyymejä B12 vitamiinia ja foolihappoa sekä aktiiveja metyylejä (SAM, S-adenosylmetioniinia) ja vitaalit entsyymit. Tokko  sellaista aineenvaihon huippua ja  synteesitehdasta on tuman puolella,  joten tuman puolen ongelma on urasiilin kertymä. On  eräs  kiertotie saada tuman puolella tymiiniä, cytosiinin metyloitumistien kautta, josta alla mainitaan. .

Cytidiinistä ( C ) taas tulee helposti urasiili (U) , kun vain yksi aminoryhmä poistuu ( deaminaatiotapahtuma) ja se voi tapahtua jopa spontaanisti, itsestään. Metyloitunut sytiini (meC) taas spontaanideaminoituu tymiiniksi DNA:ssa.( Tämä voi olla salvage tie!( mielestäni) , sillä "kallista"  tymiiniä  tarvitaan replikaatioon tietysti oikeille paikoillekin). 

Urasiilin muodostuminen on pyrimidiinirakenteitten yksinkertaisin vaihe  ja siitä kehittyy eteenpäin sytosiini tai toista tietä tymiini. Joten spontaani putoaminen urasiiliin heijastaa sekä huonoa energistä tilaa kehossa, että DNA:n degeneraatiosuuntaa. Mutta   organismilla on erittäin eleganttia  ” targeted”, tarkoituksellista urasiilinmuodostusta myös sytosiinista käsin.

(Omia pohdintoja:
 Urasiili hajoaa helpommin ja erittyy kehosta vaivattomammin kuin tymiini, joka on vaatinut myös jo rakentuakseen melkoisen hyvät olotilat ja myös sen  rakenteen hajoittamiseenkin vaaditaan samat ”paremmat” olotilat, sillä sen lopputuotteen muodostus  kuten sen oma muodostus vaatii B 12-vitamiinia. Tymiinin pyrimidiinirakenne hajoaa lopulta  BAIB tietä ja menee samaa rataa (kuten valiini ja propionihappo) kohti sitruunahappokiertoa, eli tarvitsee tavalliseen tapaan B12 vitamiinia ja biotiinia muuttuakseen metylmalonisemialdehydistä otollisempiin molekyläärisiin muotoihin.  Tässä taitaa olla ( näin arvelen) itseään negatiivisella feedbackilla säätelevä  mekanismi mukana, mikä lopulta vaikuttaa genomin miljööperäiseen  yleisikään ja miljööperäisen apoptoosin käynnistymiseen muutenkin. 

Onkohan aivan varmasti selvillä kehon proteiinin tarve? Koko ajan  löytyy lisää niitä DNA-replikaatiolaitteen tarvitsemia proteiineja. Vaatimus tymidiinin aineenvaihdunnan adekvaatista toiminnasta alusta loppuun voi olla jokin kynnys  joka loputla säätelee Genomisia replikaatio ja trqanskriptiotahteja- tietysti- Karjan "Födafaktor" tunnetaan- mutta ihmisintelligenssiä ja ihmis-ikää kohentava   "födafaktor" ei ole aivan selkeästi tiedossa, mutta sitä hahmotetaan jatkuvasti.   Ja jos genomin replikaatio/korjaus  ei voi toimia adekvaatisti , voi olla atoksisempaa tiputtaa urasiilit pois kompromissina- esim. tymiinin aineenvaihdunnan vajeen toksisuuden vältössä. Esim B12 vajeen oireet ovat  astettaisia samoin tymiinin aineenvaihdunnan myrkyttyminen.   Tymiinin adekvaatin toiminnan mahdollisuus on näkymätön asia kuin jäävuoret- jossa huippu näkyy , se  on urasiilin progressiivinen  tippuminen pois DNA:n funktionaalisesta  pyrimidiinikartasta.  Puriinin ongelmat tiedetään: kihti jne, mutta pyrimidiinin ongelmat  ovat  se näkymätön. urasiilin muodostus  on  ehkä  suojatie toistaiseksi). 

( Elinikää varmaan teoriassa pidentää, jos BAIB saadaan vaikka erittymään sellaisenaan kehosta. BAIB erittyy ilm. suurella osaa kiinalaisista ja japanilaisista sellaisenaan, joten heillä on genomia suojeleva aineenvaihdunnallinen sivutie käytössä. Tämä taas poistaa olettamani negatiivisen feedbackin DNA: tymiinilta. Tällöin genomin ei tarvitse syöttää – paremman puutteessa- ensimmäistä lähinnä tymiininkaltaista replikoitavaksi.

 Intrasellulaarisesti vallinnee vakiotasapaino dUTP ja dTTP välillä. dUTP-pitoisuus on 0,1%-1% dTTP-pitoisuudesta, kirjoittaa P Aas. Jos replikaation kiireessä puuttuu dTTP - mitä  varmaan relatiivisesti  puuttuu nykyaikana monelta -  on todennäköistä, että dUTP inkorporoituu. ”dUTP on hyvä substraatti DNA polymeraaseille”- kirjoittaa P Aas. U emäs tekee parin A- emäksen kanssa, joten asia ei ole kovin pahasti mutageeninen. Mutta pahempi seikka on se, että esiintyessään DNA:ssa U sotkeutuu promoottorielementteihin sitoutumalla sääteleviin proteiineihin. Korjausjärjestelmä taas on proteiineja, joita tarvitaan tarkempina enemmän kun on enemmän tarkkaa korjattavaa, ja siten voi taas tulla enemmän korjattavaa, kun tarvitaan enemmän korjaavia proteiineja. 

 

1960- luvun Harper mainitsee amerikkalaisesta aineistosta, että 25 % niistä, joilla erittyi BAIB, tymiiniaineenvaihdunnan lopputuotetta beta-aminoisovoihappoa, oli joku esi-isistä kiinalainen tai japanilainen ja kyse oli terveistä henkilöistä ja mahdollisesti resessiivisestä geenistä. Tähän seikkaan kannattaisi kiinnittää huomiota: BAIB-määrä on mitattavissa. samoin  B12 ja foolihappomäärät ovat myös mitattavissa- tosin  kiinnitetään huomoota vain veriarvoihin aikka B12 tarvitaan sekä aivojen autonomassa,, lihaskudoksessa,  soluissa. joten puute on monen asteista, ja veressä esiintyvä  arvo ei  kerro esim aivojen ja lihasten B12  statusta. Ei myöskään tymiinin synteesistatusta. Ehkä tymiinin metaboliastatuksen voisi kuvantaa jase  voisi merkitä Genomin  replikaation etc.   riittävää tymiinin saantia jos tymiinin katabolia   on normaali.   Verenmuodostukseen voi olla B12 ja foolihappoa  riittävästi nipin napin.  . Jos tymiinin aineenvaihdunnalliset seikat ovat esteettömät kaikin puolin, mutaatiofrekvenssi ja korjausjärjestelmien rasite pienenee. Urasiilin katabolia-alue eroaa tymiinin katabolia-alueesta. Jos nyt itse Kiinassakin olisi 25%:lla kyky erittää BAIB, se olisi jo melkoinen määrä ihmiskuntaa, eikä seikka näytä ainakaan olevan kansan lukumäärälle negatiivinen. 

Tymiini on tyyppi esimerkki " pahan kierteen" molekyylistä., " ond cirkel".  

Kun Genomissa tymiiniperäisen emäksen sijaan on tullut urasiiliperäinen emäs, on  olemassa korjausjärjestelmiä nyhtämässä ja niistämässä  pois urasiileja. Muuten tapahtuu lopulta suurempi mutaatio:  G:C pariutumisen sijasta transitioissa A:T.

 UNG geeni , Urasiili- DNA-glykosylaasi.

On olemassa pieniä proteiineja, joita koodaa UNG geeni ( Uraciili DNA glykosylaasit) .Nämä glykosylaasit eivät saa rikkoa RNA:n rakenteita eivätkä ne otakaan niitä urasiileja, jotka ovat muodossa dU, dUMP, U tai RNA. Vaan niillä on UDG-aktiviteetti, U-Dna-glykosylaasi

Urasiilin poistaminen  DNA.sta kuuluu DNA:n korjausmekanismeihin

DNA REPAIR MECHANISM on kappale sinänsä, mutta tässä keskityn vain urasiiliasiaan, joka on kappaleen alaotsikkoja.

 Siis urasiileja tulee sytosiineista  (c )  deaminoitumalla spontaanisti päivittäin 100-500 kpl ihmissolussa. Sytosiini on suojatumpana dsDNA:ssa (DNA:n kaksoishelixissä) kuin ssDNA:ssa (yksinkertaisessa DNA juosteessa) ja  se deaminoituu 100 kertaa nopeammin  yksinekertaisessa juostessa, ssDNA:ssa.

 Lisäksi DNA:ssa 3 % sytosiinista ( C )  metyloituu 5-asemaan ja 5-meC puolestaan deaminoituu  3-5 kertaa nopeammin kuin sytosiini, joten tulee tymiiniäkin. : Mutta tämä tymiini taas aiheuttaa T:G mismatch-tilanteen, ellei korjaanu ennen replikaatiota.

(Mutta nyt urasiilin puolelle).

UNG-proteiinit (uracil DNA glykosylaasit) voivat scannata  DNA:ssa ilmenevän U- nukleotidin. 

ovat kooltaan 19-35 kDa ja niillä on suuri  turnover- nopeus verrattuna muihin glykosylaaseihin. Urasiili poistuu nopeammin U:G parista kuin U:A-parista.  Urasiili, joka sijaitsee DNA:n 3´-päässä (OH- päässä) on myöskin huonompaa substraattia UNG-proteiineille kuin 5´-urasiili (fosfaattipäässä sijaitseva) jolloin desoxyriboosi (sokerirengas) on fosforyloituna. Tätä korjaavaa entsyymiä estää urasiili, urasiilianalogit 6-aminourasiili ja 5-azaurasiili.

UNG (glykosylaasientsyymi) sitoutuu ja scannaa DNA:ta pitkin pientä kuoppaa ja havainnee paikallisen helixheikkouden nappaamalla fosfaattirungosta. Kun UNG tapaa urasiilin, se taivuttaa DNA- runkoa 45 astetta ja aiheuttaa urasiilin irtautumisen helixistä ja putoamisen entsyymitaskuun. Vako on positiivisesti varautunut. Entsyymin leusiini272- sivuketju pitää sijaa rällä  tyhjällä emäspaikalla kuin ” tikkua ovenvälissä” tukeakseen extrahelikaalista konformaaiota. Urasiili roteerataan 90 astetta desoksyriboosin suhteen, jolloin glykosyylisidos destabilisoituu ( tulee epävakaaksi)  eikä DNA enää vedä sitä. (”Pinch-push-pull” on glykosylaasin mekanismi, jolla se nyhtää  urasiilin irti). Lisäksi AP- (apyrimidiini) kohta saa suojaa, kunnes endonukleaasi (APE1) ehtii sinne korjaamaan paikalle oikean emäksen,  

UNG-proteiinit ovat ERITTÄIN spesifisiä glykosylaaseja, mutta voivat vapauttaa DNA:sta myös joitain cytosiinin oksidaatiotuotteita kuten alloksaania, isodialuric-happoa, 5-hydroxyurasiilia ja 5-fluorourasiilia.

UNG-proteiinit omaavat myös erityisiä piirteitä verrattuna muihin glykosylaaseihin. Niiden aktiviteetti on 2-3 kertaa suurempi  ykinkertaista DNA-juostetta, ssDNA:ta kohtaan kuin dsDNA:ta , kaksinkertaista juostetaa kohtaan, mikä on tietysti edullinen seikka, koska ssDNA stabiliteettikin on heikompi.

UNG2 on tärkeimpiä näistä glykosylaaseista ja toimii tumassa.

UNG geenin lokalisaatio kromosomiasemassa 12q24.1.

Kooltaan UNG1 on 304 aminohappoa ja UNG2 on 313 aminohappoa.

UNG1 on mitokondriaalinen ja UNG2 on nukleaarinen ja sijaitsee replikaatio fokuksissa ja sillä on interaktiota replikaatioproteiinin A (RPA) ja muiden DNA-korjausproteiinien kanssa. Sillä on interaktio PCNA:n  kanssa ( proliferating cell nuclear antigen), joten arvellaan että se sijaitsee aivan juuri siinä, missä uusi DNA on replikoitumassa, replikaatiohaarukan edessä tai voi poistaa urasiilia (U) juuri muodostuneesta (nascent) DNA:sta. Tämä sopisikin siihen seikkaan, että urasiilin poistokyky on nopea ja mahdollisesti UNG2 pysyy samassa tahdissa nopeasti liikkuvan replikaatiohaarukan kanssa

UNG1 mRNA esiintyy kaikissa kudoksissa, eniten mitokondriapitoisissa, kuten lihas ja sydän. 

UNG2 mRNA taas esiintyy kudoksissa,  missä soluproliferaatio on korkea.

Urasiili-DNA-Glykosylaasiaktiviteetti

UDG-aktiviteetti on osoittautunut olevan solusyklin säätelemä seikka, pääsäätö tapahtuu transkriptiotasossa. UNG1-mRNA ja UNG2-mRNA säätyvät solusyklistä käsin. Myöhäisessä G1/ S faasissa säätyy nämä 2,5- ja vastaavasti 5- kertaisiksi pitoisuuksiltaan. 

Tätä seuraa UDG-aktiviteetin nousu 4-5 kertaiseksi myöhäis S- vaiheessa verrattuna alkavan G1 vaiheeseen. S- faasin jälkeen UNG2 mRNA alenee nopeasti ja UNG1 mRNA hitaasti.

 Siis: Kun on replikaatio, niin silloin UNG alkaa toimii tehokkaasti.

Miksi tämä UNG- geenifunktio on tärkeä? Immunologisen pätevyyden ja plastisuuden takia

Puhutaan V(D)J rekombinaatioista luuytimessä. 

B-lymfosyytit tekevät antibodeja ja antibodimuodostus taas tarvitsee omat vaihteensa, joka käyttää geneettistä taustakoneistoa. 

Class switch recombination (CSR) tarvitaan immunoglobuliinigeenien taustalla. B-solut omaavat tietyt geneettiset potentiaalit, kun ne ovat kypsiä ja itukeskuksissa kehossa. Niiden DNA:ssa on mahdollisuuksia äärimmäisiin erilaistumisiin, CSR-funktion  lisäksi on somaattisia hypermutaatioita (SHM) taustalla. Mm. näistä kahdesta seikasta seuraa B-solujen kyky tehdä erilaisia antigeenivasteita peruslukemilta: IgM, IgG, IgA, IgE.

Tarkoituksellinen aktivaation indusoima deaminaatio tuotaa urasiilin. 

Jos tekijä AID ( activation induced deaminase, targeted, tarkoituksella tehdyn urasiilin muodostus!) puuttuu, kehittyy liikaa IgM-tyyppistä immunoglobuliinia   (CSR ja SHM funktioita  ei esiinny), sekundaari lymfakudos on proliferoitunutta. 

 Saman tapaista aiheuttaa, jos UNG2- vajetta esiintyy. (CSR on häiriintynyt ja SHM puutteellinen) 

Tässä tarkoituksellisessa  sytosiinin deaminaatiossa urasiiliksi (AID)   on kyse tilanteesta, missä Cytosiinin muutosta Urasiiliksi keho käyttää hyödykseen  tehdessään kohde-DNA.ssa, ( target DNA) merkin joka toimii lopulta vaihteena:  UNG2 tekee Abaasisen kohdan, joka voi prosessoitua molemmat vastaavat DNA-emäkset poistavaksi hyvänä merkkinä vaihdealueessa, stanssi! ,  (ja itse asiassa minimaalinen DSB) ja  NHEJ korjausjärjestelmä liittää   päät kuten V(D)J- rekombinaatiossa (NHEJ, non- homologous end-joining). Tämän function vaurio altistaa bakteeritulehduksille. 
 (Huomn.  NHEJ funktio taas tarvitsee tarkentajana IP6-tekijää, joka on ravintotekijä. 14.10.2015).

Muut Urasiili -DNA Glykosylaasit (UNGs)

In vivo on muitakin UDG aktiviteettia omaavia entsyymeitä urasiileja irrottamassa kuin e.m. UNG- geenin koodama UNG. On mainittava ainakin kolme muuta: TDG, SMUG1 ja MBD4, jotka pystyvät ottamaan urasiileja pois DNA:sta. Ne poistavat myös eräitä urasiilianalogeja kuten 5-hydroksymetylurasiilia, 3,N-etenosytosiinia, 5-fluorourasiilia. (UNG2 ja SMUG1 poikkeavat muista glykosylaaseista siinä, että ne pystyvät irrottamaan korkeammalla aktiviteetilla U:n ssDNA.sta).

SMUG1 (1999, 2001,2003)

on Single- strand selective monofunctional Uracil-DNA glykosylase ( 1999) . Nimi on sikäli erheellinen että se ottaa urasiilia sekä U:G että myös U:A- pareista. Poistaa myös 5-hU ja 5-foU.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 12q13.1-q14.

Koko 270 aa.

TDG (1993, 2002)

on T(U)mismatch glykosylaasi, joka ottaa pois T tai U-emäksen dsDNA- mismatch tilanteessa. Entsyymi hoitaa ensisjaisesti U:G mismatch ja sitten T:G mismatch- tilanteen. TDG on reportoitu transkriptiotekijäksikin.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 12q24.1.

Koko 410 aa.

MBD4, myös käytetään nimeä MED1 (1999, 2001)

Tämä ” methyl- binding domain protein 4” on monofunktionaalinen glykosylaasi, joka sitoutuu T:G tai T:U mismatch kohtiin ja vapauttaa T tai U näistä kohdista. Se kiinnittyy myös metyloituneeseen DNA:han in vitro ja saattanee vastavaikuttaa siihen mutageenisyyteen, mikä seuraa 5-metyylisytosiinin (5-meC) deaminoituessa tymiiniksi (T).

Tämän entsyymin kunto on syövän suhteen estävä seikka (1999)!

Entsyymissä on glykosylaasi-domaani ja erillinen metyyliä sitova domaani. Tässä on kohta, joka on onkologian suhteen tärkeä.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 3q21.22.

Koko 580 aa.

Yhteenveto siitä, miten urasiilia tai hydroxymetylurasiilia voi korjata pois genomista

Replikoitumattomasta tai replikoituvasta osasta.

( Tri P Aas piirsi tästä kuvan)

Nukleoplasmi / nukleoli, replikoitumattoman osa korjaus 
 

a. Tymiinin (T) oksidaatiosta on tullut 5-HmU:A

Tymiinin oksidaatiosta ja deaminatiosta  on seurannut 5-meC ja täten 5-meU:G

Tilanne: Kromatidissa esiintyy parit HmU:A ja HmU:G.

Korjaus: SMUG1

Short patch BER (Base Excision Repair): APE1 (AP endonukleaasi) , polymeraasi beetta, XRCC1, LigaasiI, Ligaasi III

(BER-tie poistaa solusta päivittäin 10 000 DNA leesiota)

b. Cytosiinin ( C ) deaminaatiosta on seurannut dsDNA tai ssDNA:ssa virhe urasiili.

Tilanne: U:G mismatch

Korjaus UNG2 ( nukleoplasma);

SMUG1 ( nukleoli),

MBD4 (MED4, methyl binding domain4),

TDG; T(U) mismatch glykolase)

Short patch BER: APE1, polymeraasi beetta, XRCC1 ( BER- koordinaattoriproteiini),

Ligaasi I ja Ligaasi III

Multiproteiinikompleksi UNG2:n kanssa.

Replication foci, Replikaatiokohdan korjaus

a. Cytosiinin deaminaatio ssDNA:ssa tapahtunut.

Tilane: esiintyy U

Korjaus: UNG2

Urasiilin excisio, poistaminen UNG2-entsyymillä; haarukan regressio tai rekombinaatio käyttämällä informaatiota sisarkromatidista, joka tässä kohdassa nyt on kapeasti ds; tai transleesiosynteesi (TLS)

b. Replikaation tapahtuessa inkorporoituu vahingossa dUMP.

Tilanne: tulee epäsopiva pari U:A mismatch

Korjaus: UNG2

Long patch BER: APE2 (?),

Polymeraasi delta ja epsilon, PCNA, FEN1 (flap endonuclease 1) , Ligaasi I.

(DNA-korjausmekanismeista teen suomalaista yhteenvetoa tästä allaolevasta lähteestä)

Lähde:

1. AAS PER ARNE

(NTNU 2004 Norwegian Cancer Society)

Macromolecular maintenance in human cells - Repair of uracil in DNA and methylations in DNA and RNA

2. Harper::Review of physiological chemistry