Väitöskirja ( F Erlandsson) vuodelta 2004 solusyklimoottoreista (Cyc-Cdk) ja niiden säätelystä taustaa

ERLANDSSON Fredrik. Immunofluorescence studies on the cell cycle expression of cyclin A and cyclin E. (KI STH 2004)   Kertausta

https://openarchive.ki.se/xmlui/handle/10616/38354?locale-attribute=sv

Syksyn 2004 kirjastokäyntien yhteydessä oli kirjaston poistodupleteissa

(poislahjoitettavien ) joukossa myös tämä väitöskirja, josta saa lisävaloa solusyklin säätelyyn. Suomennan joitain tavalliseen järkeen käypää tekstiä, mutta varsinaisen tieteellisen osan neuvon noutamaan lähteestä:

ISBN 91-7349-809-2.

Väitöskirja on julkaistu ja painettu Tukholman Karoliinisen yliopiston kirjapainossa, Box 200, SE- 171 77, Stockholm.

Kirjan alkuosassa kuvataan perustavaa tietoa solusyklistä uusimman käsityksen mukaan. Tutkija on sitä mieltä että biologinen solu on omannut jo 3 biljoonaa vuotta solusykliä. Vuonna 1858 kuitenkin Virchow oli havainnut että animaalisesta solusta tulee animaalista ja kasvissolusta kasviskudosta ja genomi kantoi ominaisuutta edelleen. Siis alkusolukot ovat ilmeisesti mutatoitunut suuresti erilaisuuksiin, jotka ovat jatkumoita meidän pienessä ajanlaskussamme.

Syöpä aiheutuu solujen muuntumisesta, transformaatiosta ja tällöin on aina kyse solusyklin säätelyjärjestelmän puutteista ja ontumisista. Tuloksena on geneettinen instabiliteetti, jossa DNA:n toistaminen tulee virheelliseksi ja kaksinkertaistuneen DNA:n erilleen vetäytyminen ei tapahdu optimaalisti. Tämä johtaa uusiin karakteristikoihin ja tuumoriprogressioihin.

Miten vaurioitunutta DNA-materiaalia pääsee solusyklin kontrollijärjestelmän läpi ?. Solusyklin säätelijäjärjestelmässä on täytynyt tapahtua mutaatioita ja solu ei pysty erottamaan väärää ja oikeaa.

Lisää tietoa solusyklistä:

Sykliinit (cyc) ja kinaasit ( Cdk)

Cdk- entsyymit ja niiden säätelevät alayksiköt, sykliinit, ovat keskeisiä solusäätelyssä ja jokaisessa solusyklin faasissa on oma tyypillinen Cdk-sykliini-kompleksinsa toimimassa. Ne toimivat fosforyloimalla kohdeproteiinejaan. Ne ovat “ moottoreita”.

Sykliini E-Cdk2 - kompleksi on aktiivi Gap1- faasin myöhäisvaiheessa ( pre-DNA-synteesivaiheessa) ja fosforyloidessaan proteiineja se saa aikaan progression G1- vaiheesta S-vaiheeseen (DNA-synteesivaiheeseen).

Sykliini A - Cdk2 –kompleksi on aktiivi S-faasissa ( DNA-synteesin aikana, kun DNA kaksinkertaistuu) ja G2-faasissa ollen essentielli progressiossa synteesistä mitoosiin siirtymississä.

Koska perinteiset tutkimusmetodit vaikuttavat solunsisäisiin tekijöihin, tutkija käytti uutta immunifluoresenssitekniikkaa, jolla hän sai selkeämmän kuvan näistä tumatapahtumista pystyttyään mittaamaan semikvantitatiivisesti suuren joukon soluproteiineja. (Triple immunofluorescence staining protocol)

DNA:n itsensä uskollisesti toistavassa synteesissä, replikaatiossa, tärkeät keskeiset sykliinit ovat sykliini A ja sykliini E.

Sykliini A näyttää kertyvän tarkasti siinä vaiheessa, kun solu siirtyy S- faasiinsa ja täten osoittaa Gap1/S- transitiokohtaa. Tämä sykliini A.n kertymä on samanlaista niin normaalissa kuin muuntuneessa solussa. Muuntuneessa solussa ei tapahdu sykliini A deregulaatiota.

Näin ei ole sykliini E.n kanssa.

Päinvastoin sen kertymätapa on hyvin erilainen normaalissa ja muuntuneessa solussa. Normaalisti Gap1-faasissa solun päätettyä ruveta progredioitumaan ( eli astuttua yli R-haamurajan: executio progredioinnista tehty), sykliini-E tekee nopean korkean piikin ( G1 ps) eli aivan juuri ennen kuin DNA rupeaa kaksinkertaistumaan ja sitten se laskee yhtä nopeasti ja siinä samassa siirtyy solu S- faasiin ja DNA alkaa kaksinkertaistua.

Kuitenkin huomataan että tämä toimimisen alkujärjestelyjakso voi olla hyvin nopea, välitön, tai hyvin pitkä jopa 20 tuntia - jostain systä. Solu on päättänyt alkaa jakautua, mutta toiset tekevät sen heti ja toiset jonkin ajan päästä

Entä muuntunut solu?

Siinä sykliini E ei hajoakaan, vaan sen akkumulaatiota nähdään kautta S-faasin. Jopa sen akkumulaatiotavasta saatettiin päätellä tuumorikasvun pahanlaatuisuus ja henkilön prognoosi.

Mikä on tyypillistä normaalille solusyklille?

Normaalille solusyklille on ominaista, että DNA kopioituu uskollisesti ja oikein ja jakautuu, segrekoituu kahdeksi identtiseksi tytärsoluksi. Normaalisolu pysäyttää progredioitumisensa, jos on DNA-vaurio ja / tai korjaa vaurion. Normaalisolu reagoi miljöönsä signaaleihin joko pysäyttämällä progredioitumisensa tai arvioimalla suoriutuvansa koko syklistä. Tästä johtuukin DNA:n korkea-asteinen täsmällisyys ja huikean plastiset reservit- jotka muovaavat funktioreserviä korjauksille. Erikoista on, että Gap1 pm vaihe, ulkoisen miljöön analysoimisvaihe on aina sama 3.5- 4 tuntia - siis väsymätön tullaaja ja kontrollantti miljoonia vuosia - se ei koskaan usko, että ”jaa- kyllä tuo nyt voidaan tehdä sarjana, kun on ollut niin hyvä jo sata vuotta, niin että antaa mennä suoraan eteenpäin.”. Kun tämä ikikontrolli on tehty (3.5-4 tuntia !) , sen jälkeen solu voi sitten omien varojensa mukaan progredioitua. Ikäänkuin asia siirtyisi ulkoministeriöstä ( gap1 pm) sisäministeriöön ( gap1 ps)- ulkorajoilta sisämaahan.

Jokainen ”vastasyntynyt” solu siirtyy heti Gap1 pm faasiin ”tullaukseen”. Jos ulkoiset sanomat, signaalit, kaikenlaiset kasvuhormonit, kuten IGF, PDGF, EGF, NGF, antavat summasanoman, että solulisää ei tarvitse, solu siirtyy lepotilaan - quiescence- kuin koodin kantavana muistisoluna G0 (suljettuna koodina), jossa on kuitenkin kapasiteettia aktivoitua tarvittaessa.

Solun päätös jakaantumisesta on jollain tavalla “all or nothing”-periaatteella, kuten esim sydänlihassolun sähköinen toiminta ( se joko supistuu kokonaan tai ei lähde supistumaan): Solu siirryttyään R- kohdan yli on sisäisesti päättänyt SEKÄ intensiivisen DNA:n kaksinkertaistamisensa ETTÄ sen jälkeen kahdeksi tytärsoluksi hajoamisensa.

R-kohta keskellä Gap1 vaihetta

Tuo R-kohta (R-point, restriction point), jossa aktiopäätös aletaan realisoida, esitettiin konseptina vuonna 1974. R- pisteen jälkeen ei ulkoiset tekijät enää pysty muuttamaan aktiosuuntaa tai sammuttamaan alkanutta vektoria. Solu ei ole enää vaikutettavissa, vaikka kasvutekijät puuttuisivat R- kohdan ohittamisen jälkeen, vaan solusykli menee täydellisesti päätökseen.

Lepotilasolu, koodin säilyttävä

Jos solu on sitä mieltä että ei ole tarvetta eikä resursseja jakaantua kahdeksi, se säilyttää itsensä lepotilassa. Uusi solu, joka syntyy, menee suoraan Gap1 pm vaiheeseen kontrolliin, ja voidaan asetettaa tällaiseen lepotilaan, muistisolutilaan , quiescence, G0- vähän niinkuin nälkäajan laihana tuloksena- tai pelkastään siksi, että ei ole tarvetta, tai siksi, että se on aivan terminaalisesti jo erikoistunut, jolloin taas olisi tärkeä pysyä siinä G0 tilassa. Siinäkin on oma säätelynsä.

R- pisteen jälkeen

Gap1-ps vaihe käytetään tarvittavaan energia-aineksen akkumulaatioon, että olisi runsaat varastot nopeaan DNA-replikoitumiseen sittemmin S- vaiheessa, koska kerran on päätetty progredioitua.

Tässä (Gap1 ps faasissa) vaikuttaa, kuinka nopea aiempi sykli oli ja paljonko tytärsolu toi mukanaan perittyä materiaalia. Gap1 ps -vaiheen pituus on suhteessa solun kokoon, hyvinvointiin.

Solusyklin moottorin säätö

Aiemmin mainitut sykliineistään riippuvaiset kinaasit (Cdk) ovat se päämoottori, jolla solusykli sitten toimii. Fosforyloiminen on niiden tapa vaikuttaa.

Niitä voidaan säätää pääasiassa neljällä eri tavalla:

1. Aktiivit Cyc-Cdk- kompleksit : Tärkein näistä moottorinsäätötavoista tavoista on inaktiivin Cdk -molekyylin ja sykliinin sitoutuminen toiseensa aktiiviksi kompleksiksi. Erilaisia sykliinejä ( D, E, A, B) on tumassa sen eri vaiheissa ja käyrääkin voidaan piirtää näiden sykliinipitoisuuksien oskillaatioista seuraavasti.

Sykliini D- esiintyy kautta koko syklin tasaisen aaltomaisesti, aallolla on kuitenkin hieman kuperaa huippua Gap1 alueella. ( Liittyy Cdk 4, 6 kinaaseihin) ja toinen G2 alueella.

Sykliini E, kuten edellä mainittiin, esiintyy Gap1 ps vaiheessa terävänä, korkeahuippuisena piikkinä, joka heti laskee G1/S rajassa. ( Liittyy Cdk2:een)

Sykliini A alkaa nousta G1/S rajasta kohoten pitoisuudessa vielä Gap2 alueella ja laskee vasta M faasissa ( mitoosissa) alas. ( Liittyy aluksi Cdk2:een, sitten Cdk1.een.) Sykliini A kattaa DNA synteesiin ja solukasvuun kuuluvat vaiheet.

Sykliini B esiintyy kapeana piikkinä vain M-faasissa.(liittyy Cdk1:een) ja hajoaakin sen faasin kuluessa, se pääasiassa tarkentaa ja tehostaa genomin jaon kahteen samanlaiseen joukkoon.

2. On aktivaattoreita: Sykliini-Cdk kompleksi säätyy aktiiviksi reversiibelillä sykliiniosan fosforylaatiolla (160-P)

Sellainen aktivaattori kuin ” cyclin activating komplex” (CAK) esiintyy kaikissa soluissa ollen ilmeisesti miltei aina aktiivi. Se muodostuu seuraavista tekijöistä: Sykliini H, Cdk7 ja Mat1.(1995)

3. On fosfataaseja ja kinaaseja: Kuitenkin substraatin paikka tuossa sykliini-Cdk-kompleksissa voi fosforyloitua lisää ja täten aktiivi kompleksi inaktivoituu (Esim lisäfosforylointien kohdat 15-P, 14-P).

Näitä kohtia fosforyloi joukko erilaisia kinaaseja ( Wee1, Myt1).

Toisaalta sellaisia fosfaatteja voi irrottaa inaktiivista kompleksista Cdc25- fosfataasit ja silloin aktivoituu kompleksi, solusyklimoottori, uudestaan.

Wee1 ja Cdc25 aktiviteetteihin vaikuttaa kovasti solunsisäiset tekijät, kuten DNA-vauriot.

4. On inhibiittoreita: Cdk inhibiittorit (CKI) voivat estää aktiivin sykliini-Cdk-kompleksin sitoutumalla aktiiviin kohtaan.

CKI-ryhmät olivat INKR ja CIP/KIP ryhmät:

INK4-inhibiittorien ryhmä ( p15-INK4b, p16-INK 4a, p18-INK 4c, p19-INK 4d ).

Ne vaikuttavat liittymällä Cdk4 ja Cdk5-kinaaseihin.

CIP/KIP-inhibiittoreitten ryhmä ( p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1, p57 KIP2) Nämä vaikuttavat sitoutumalla sykliini-Cdk-komplekseihin, joissa esiintyy Cdk1, Cdk2, Cdk4 ja Cdk6. ( Jokin poikkeus on näitten toiminnassa jossain yhteydessä ne lisäävät kinaasiaktiviteettia)

.Solusyklin ajalliset vaiheet

Gap1 vaihe 4 tuntia. Sen alkuosa on pm, postmitoottinen vaihe.

Restricton point, R- point sijaitsee noin 3.5-4 tuntia Gap1 faasin alusta.

G1 ps, Gap1 faasin loppuosa R-kohdan jälkeen on pre-DNA-synteesivaihe.

G1 ps vaihtelee tunnista yli 16 tuntiin.

S-faasi on 7 tuntia.

Gap2 faasi 2 tuntia

ja M ( m1toosifaasi) 1 tunnin.

Miten solu havaitsee solun ulkopuoliset signaalit?

Miten solu kykenee tunnistamaan, paljastamaan ( detect) solun ulkoisia kasvusignaaleja?

Monisoluiset organismit ovat hyvin herkkiä ulkoisille tekijöille, koska niitten on keskenään koordinoiduttava elossapysymiseen tai apoptoosiin koko organismin hengissä pysymisen hyväksi, kun taas muuntunut solu on tyyppiominaisuudeltaan välinpitämätön ulkoisista signaaleista. Tästä voi päätella, että koko se molekulaaristen teitten järjestelmä, mikä kykenee havaitsemaan solun ulkoisia kasvusignaaleja on potentiellejä proto-onkogeenejä.

Kasvutekijäreseptori

On olemassa lukuisa joukko erilaisia kasvutekijöitä omine erillisine signaali-kaskadeineen, kuten seuraavat kaskadien omaavat kasvutekijät: insuliinin kaltainen kasvutekijä ( IGF), trombosyyttiperäinen kasvutekijä( PDGF), epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja neuronaali kasvutekijä (NGF).

Moni kasvutekijä havaitaan solun kalvossa sijaitsevan tyroosiinikinaasireseptorin (tkr) avulla.Näissä reseptoreissa on 2alfa2betarakenne. Alfayksköt ovat solun ulkopuolisia ja niihin kasvutekijä kiinnittyy ligandina. Beta-yksköt ova transmembraanisia ja ne taas autofosforyloituvat, kun kasvutekijä asettuu reseptoripintaan. Tästä taas aktivoituu tyrosiinikinaasi näissä betayksiköissä. Tästä taas seuraa, että kohdeproteiineissa pääsee monet tyrosiinit fosforyloitumaan, kaskadin olennaisin signaalimolekyyli myös. Sen initiaalinen muodostus voi olla hyvin vähäinen, mutta signaali vahvistetaan solun sisällä (amplification) Eräs tällainen kaikkein tutkituin signaalikaskadijärjestelmän moduli on p42 / p44 / MAPK ( mitogeenin aktivoima proteiini kinaasi).

Ras, Raf, MEK ( MAPK, ERK) signalointitie solumoottorin käynnistykseen.

Sellainen G-proteiini ( energiajärjestelmästä GTP riippuva) nimeltä Ras aktivoituu ja rekryteeraa seriini-threoniinikinaasin Raf solupintaan. Tämä Raf on sellainen, että jos yli 5 % sen määrästä pääsee aktivoiduksi, se riittää aktivoimaan solun sisätilassa kaiken ERK- määrän. Ensin se fosforyloi ja aktivoi MEK (=MAPK tai ERK kinaasin) Siis pienellä Raf- aktivaatiolla fosforyloituu puolestaan solun sisällä kaikki ERK- määrä.( entire cellular ERK pool) Nämä ovat “extracellular regulated kinases”.Tässä tapahtui siis signaalin vahvistus. Aktivoitu ERK vaaditan fibroblastisolujen proliferaatioon. ERK puolestaan vaikuttaa fosforyloimalla transkriptiotekijöitä.

Päävirta ( downstream) tässä on Ras aktivaatiosta ERK signalointikaskadiin, mistä seuraa sykliini D muodostusta ja näin vaikuttuu solusyklin koneisto, kun voi muodostua aktiivia kompleksia sykliini D-Cdk4,6.

Signaalikaskadeja: Muita samantapaisia signaalikaskadeja on olemassa

Eräs käyttää modulia p38 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase).

Eräs käyttää modulia BMK1 / ERK5

Ja eras käyttää modulia JNK

Modulijärjestelmä p42 / p44 MAPK ja BMK1 / ERK5 vaikuttuvat extrasellulaarisista kasvutekijöistä.

Modulijärjestelmä p 38 MAPK ja JNK ovat toiminnassa, kun on kyse signaloinneista, joka on vastetta stressiin ( stress response signalling).

Integriini

MITEN SOLU VALMISTAUTUU PESÄNTEKOON ENNEN KUIN TYTÄRSOLUT TUOTETAAN?

Sen lisäksi, että solu tutkailee ympäristönsä signaalit, se myös varmistaa tukevan olotilan itsellensä- eräänlaisen ponkaisualustan. Se ei lähde tyhjän päälle, ”avaruusoloissa” jakaantumaan. Miten tämä avaruudellinen hahmottuminen solussa tapahtuu ? (Detection of cell adhesion).

Tämän turvallisen liittymisen tulee tapahtua Gap1 vaiheessa ennen kuin solu siirtyy progredioitumaan. (Tuumorisolut menettävät tämän ominaisuutensa ”olla kotiin päin” transformoituessaan)

Solun sisällä on höttöinen sytoskeleton. Solukalvo ympäröi sisällä olevaa sytoskeletonia. Integriininimiset rakennelmat (transmembraanit heterodimeerit 2alfa2beta) toimivat kuin ”siipiruuvi-mutteri-järjestelmänä” ympäri solumembraanipinnan ”Siipiruuvi” omaa pari solun ulkopuolelle ulottuvaa ”siipeä”, peptidisilmukkaa ( 2 alfa yksikköä) ja ruuvina toimii kapea kiemurainen transmembraaninen (TM) osa (2 betayksiköä) ja ”mutterina” toimii molekyylin soluliman puolelle ulottuvat aminohappoketjulenkit , joihin entsyymit vaikuttavat. Kun integriini aktivoituu ulkoa, sen aktivaatio on paljon heikompi asteinen, kun kasvutekijäreseptorissa, mutta integriinejä on paljon enemmän lukumäärältä kuin vahvemmin signaloivaa kalvoreseptorityyppiä. Integriini siis omaa reseptoritehtävän lisäksi adheesiotehtävän ja saa tietää, milloin täytyy tarkemmin pitää solurakennetta paikallaan, kun se paralleelisti myös aktivoituu. Solun sisäpuolinen osa sitten fosforyloituu ja aktivoituu tehden eräänlaisen ketjureaktion soluliman sytoskeletonin puolen filamenttien ja aktiinien kesken, että siellä tulee tukevampi looginen sisäverkosto- ”sisälihasten” korvikkeet.eräänlainen ” asian riippusilta” . Samalla solun ulkopinta -alue kiinnittyy extrasellulaarimatriksin (ECM) proteiineihin.

Integriinin tehtävä on fiksoida sisätila hieman järjestäytyneemmäksi, tukevammaksi ja ulkotila paikallaan pysyvämmäksi, riittävällä adheesiolla, jotta solutapahtumat voisivat olla kontrollin alla. Integriinin tyvessä solun sisäpinnalla onkin FAK ( focal adhesion kinase), joka paikallisesti avustaa integriiniä, kun solu on alkamassa progredioitua. FAK myös pitää huolta, että CKI -inhibiittori p21 pysyy matalana. FAK myös aktivoi ERK ja niin pääsee sykliini D vapaasti muodostumaan tätäkin tietä.

( Extrasellulaari signaali –Integriini –-FAKaktivaatio -MAPK/ERK- Sykliini D).

(Kun sitten varsinainen mitoosi alkaa, M-faiheen Sykliini B-Cdk1-kompleksi -lisäksi jähmettää sytoskeletonin liikumattomaksi fosforyloiden integriinien valmistaman sytoskeletonrakennelman siksi hetkeksi, kun metafaasilevyt kytketään irti toisistaan).

Gap 1

Sykliini D (CycD)

integroi extrasellulaariset signaalit Gap 1 vaiheessa.

Näin kasvusignaalien antama tieto soluadheesion riittävydestä konvergoituu integriinien antaman tiedon kanssa siinä, että aktiivia solusyklin moottorivoimaa sykliini D-Cdk4,6 generoituu kahta tietä sopivasti.

Mikä merkitys sykliini D:n tasapainoisella muodostuksella on? Jos sitä muodostuu jostain syystä liikaa, menettää solu käsityksen pesänteon tarpeellisuudesta, ankkuroitumisen olennaisuudesta ja rakennusaineiden tarpeellisuudesta ja alkaa nopeuttaa jopa nälkätilassa / muusta syystä lepotilaan menneitten G0- lepotilasolujen siirtämistä proliferaatioon, villikasvuun.

Millä molekulaarisella mekanismilla Gap1 vaihe siirtyy progredioitumaan?

Solusyklin Gap1 pm vaihe on olennaisesti ainoa vaihe, jossa ei esiinny Cdk-aktiviteettia.

( solusyklin koneen aktiviteettia) vaikka ” kone on olemassa ”. Onhan matkaan valmis lentokone ennen lentoon lähtöä olemassa, vaikka se ei lennä. Ei lentoon lähtö muuta sitä olemattomasta olevaiseksi.

Siis alkuvaiheessa solu tekee hetken ajan realiteettitestia ja arvio mahdollisuuksaan selvitä yksi solusykli kuin yksi lentomatka. Solu ei voi keskeyttää sykliä, sen on tehtävä se loppuun, jos se alkaa. Se ei mene taaksepäin, presiis kuin yksi lentomatka- kone ei lennä peruuttamalla. Tietysti on hätälaskumahdollisuudet, mutta yleensä lähtö tapahtuu järkeistetyllä resurssivalmiudella, joka on tarkoitettu täydelliseen matkaan.

Jos on a) riittävät kasvutekijät ja b) riittävä stabiliteetti, turvallisusjärjestelmät, sykliini D liittyy Cdk4,6 kinaaseihin ja nopeasti kasvaa aktiviteetti Cykliini D-Cdk 4,6 ( syklin moottorivoima) varhain Gap1 vaiheessa. Aktivoitu CykD-Cdk4,6- kompleksi fosforyloi tarvittavat proteiinit, jotta siirtymä S-faasiin voisi alkaa.

On eri sykliinit eri solusyklivaiheissa

Eri sykliinithän oskilloivat syklin aikana.

(Ennen S-faasia tarvitaan vahva sykliini E-piikki, joka heti hajoaa ja antaa sykliini A-piikin nousta S- faasin ja G2-faasin ajaksi. Mitoosissa vallitsee terävä sykliini B - piikki.

Eri sykliinit taas puolestaan liittyvät eri tavalla kinaaseihinsa, ”tanssissaan”ja täten moottori kuin vaihtaa polttoaineintensiteettiään eri vaiheessa tarpeen mukaan. Kyse on vaihteistakin, jotka eri faaseissa vallitsevat ja niiden tulee olla keskenään hyvin integroidut, kuten ei voi käyttää kahta vaihdetta samaan aikaan tavallisessa autossakaan.

Tutkija kuvaa sitä järjestelmää, miten saadaan täsmällisesti sykliini E.tä muodostumaan runsaasti ja sitten yhtäkkiä taas se loppuu ja sykliini A.ta kertyy runsaasti. Tämä on siis se normaali tapa. Syöpäsolu ei pysty säätelemään tätä tarkasti, vaan sykliini E ”jää päälle”.

Sykliini E

Aloittava initiaalinen, triggeröivä sykliini E muodostuu seuraavasti.

On löydetty eräs proteiini RB ( retinoblastoma gene product, perhe, jossa on pRb, p107, p139) .). Kun pRb ei ole aktivoitu, ollen tällöin fosforyloimaton, se sitoo tekijää E2F joka on DNA promoottoori. ( E2F löydettiin DNA-adenovirusta tutkittaessa etsittäessä DNA promoottoria). RB-perheen jäsenet säätelevät E2F- joukkoa moniasteisesti.

estäen väärän hetken aktiivisuuden transkriptiossa.

Jos RB fosforyloituu, ( Restriktio-kohta?), se joutuu irrottamaan E2F joukkoa, joka pyrkii heti tuman sisään ja vaikuttaa DNA-promoottorina transkriptioproteiineihin, joita DNA-replikaatio vaatii. Jotta se ei ”haulikolla ammu varista” ja aktivoi kaikkea kerralla, on sen aktivaatio säädetty tarkasti, koska se voi aktivoida syntymään sykliiniä E: ja sykliiniä A, DNA-polymeraasi alfaa, OrigC, MCM, Cdc6 ja E2F1, p107, Cdk2, Cdc2, tk. Esim seuraava askel säädössä on havaittu:

Heti kun sykliiniä E on muodostunut, voi muodostua ” moottoritekijää” Cyc E-Cdk2 ja kun se taas aktivoituu, se fosforyloi lisää irtonaista E2F ( RB-pinteestä) . Tämä on tavallaan jo nopeaa amplifikaatiota. Mutta koska pitää vielä jarruttaa muita tekijöitä, kuten sykliini A.ta, on hienosäätölisää, sillä sykliini E -ja sykliini A-eritykset ovat tiukasti säädetyt terveessä solusyklissä. Kun sykliini E - piikki on loppu, niin sykliini A alkaa nousta. Se on siirtymäkohta Gap1 vaiheesta S- vaiheeseen.

Hienosäätö:

Sykliini E-synteesiin vaikuttaa stimuloivan E2F-ryhmän lisäksi eräs jarrukompleksi, jota merkitään seuraavasti: pRB-hSwi /Snaf -HDAC complex. Tämä kompleksi ESTÄÄ sykliini E-transkription, joten se jarru täytyy jollain tavalla kytkeä pois estotehtävästä samalla. (HDAC on histonideacetylaasi. Sitä ja Swi ja Snaf tarvitaan kromatiinimodifikaatiossa). Jos HDAC irrotetaan kompleksista, saadaan Sykliini E syntetisoitumaan ja samalla jarruttuu kuitenkin sykliini A-syntetisoituminen.

Tämä tapahtuu jo, kun sykliini D-Cdk4,6 fosforyloi Rb proteiinia, HDAC siirtyy pois tuosta estokompleksista, jolloin sykliini E- pääsee muodostumaan yksin ja tarkasti.

Näin modifioitu estokompleksi taas sallii vain sykliini E.n syntymisen, mutta estää sykliini A-aktivaatiota niin kauan kuin pRb fosforyloituu edelleen.

Sitä RB-lisäfosforylaatiota taas pitää yllä toinen juuri samalla kehittyvä moottorivoima Cykliini E-Cdk2, joka toimii Gap1 faasin loppuosassa.

SykliiniE-pitoisuuden tulee nousta tarpeeksi korkeaksi piikiksi, ennen kuin salliutuu sykliini A-muodostus.

Sykliini E valmistaa solun S-faasiin.

Sykliin E-liittyy Cdk2-kinasiin ja kompleksi Cyc E-Cdk2 toimii myöhäis Gap1 vaiheessa,, joka oli se pre-DNA-synteesivaihe.

Tässä vaiheessa tämä soluvoima, solumoottori , säätelee useita essentiellejä solufunktioita, kuten muuttaen ORC ( origin of replication complexes) muotoon pre-RCs ( pre-replication complexes)- jolloin DNA on saanut ”lisenssinsä” replikoitumistarkoituksiin.

Myös tämä solumoottori indusoi sentromeerin duplikaation ( vuonna 1999 havaittu). Tämä seikka taas on välttämätön, jotta solusykli päättyy täydellisen onnistuneesti.

Jarrujärjestelmä Gap1 faasin progredioitumiselle

G1 arrest, Gap 1 vaiheen jarruttuma välittyy kahden CKI ( Cdk inhibiittori) perheen jäsenten pitoisuuksien noustessa. Erilaiset syyt voivat johtaa jarruttumiseen. Näitä on ainakin 4 eri ryhmää.

1. Kasvutekijöitten vaje
2. Extrasellulaariset jarrusignaalit
3. DNA-vaurio
4. Onkogeenien aktivoituminen

1. Kasvutekijöitten vaje aiheuttaa jarrutuksen

Inhibiittoriryhmät, D-sykliinivähyys, inaktiivi moottori

(Pitää palauttaa mieleen inhibiittoriryhmiä Cdk inhibiittorit (CKI) voivat estää aktiivin sykliini-Cdk-kompleksin sitoutumalla aktiiviin kohtaan.

CKI-ryhmät olivat INKR ja CIP/KIP ryhmät:

INK4-inhibiittorien ryhmä ( p15-INK4b, p16-INK 4a, p18-INK 4c, p19-INK 4d ).

Ne vaikuttavat liittymällä Cdk4 ja Cdk5-kinaaseihin.

CIP/KIP-inhibiittoreitten ryhmä ( p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1, p57 KIP2) Nämä vaikuttavat sitoutumalla sykliini-Cdk-komplekseihin, joissa esiintyy Cdk1, Cdk2, Cdk4 ja Cdk6. ( Jokin poikkeus on näitten toiminnassa jossain yhteydessä ne lisäävät kinaasiaktiviteettia)

Koska ollaan Gap1 faasin alussa siinä toimii jarruna CKI inhibiittoriperhe CIP/KIP joka voi jarruttaa Cdk4,6 ja Cdk2- sisältäviä solumoottoreita vaikuttamalla p27 –hajoamista estämällä.

Siis sekä Gap-faasin alku-, että loppuosassa se estää. Kun p27 kertyy, sen kertyminen on jarruna leposolujen lähtemiselle progredioitumaan. P27 kertymä pitää G0 solun G0-soluna. Lisäksi niitä pitää rauhan tilassa D-sykliinin matala pitoisuus ja edellämainittujen moottoreiden inaktivaatiotilat.

2) Extrasellulaariset jarrutekijät

Sen lisäksi että voi olla vaikuttamassa solun ulkoisten kasvutekijäin puutetila, voi olla myös suoranaisia kasvunestotekijöitä olemassa: Kasvun inhibiittoreita. Yksi näistä on interferoni alfa ( IFN alfa). Se aiheuttaa Gap1- faasin jarruttumisen säätämällä seuraavat inhibitoriset tekijät ylös: CKI p15, p16 ja p21.

3) DNA-vaurio aiheuttaa solun Gas-1 faasin jarrutuksen, The Guardian of the Genome, p53

p53 järjestelmä:

Ei ole aivan kokonaan tiedossa, miten solu kykenee arvioimaan omat vaurionsa.

Tutkija mainitsee tässä yhteydessä eräitä mekanismeja:

Jonisoivan säteilyn aiheuttaman ” double strand break” (DSB) -vaurion havaitsee geenituote ATM. Se aktivoituu ja fosforyloi Chk1, Chk2(Cds1) ja p53. Kun Chk2 fosforyloituu ja aktivoituu, se vaikuttaa lisää p53 fosforylaatiota ja aktivaatiota. Tämä tekijä p53 on transkriptiotekijä. Sitä pitää toimimattomana MDM2 ja samalla kuljettaa sitä sytoplasmaan hajoitettavaksi. Mutta kun p53 pääsee aktivoitumaan, se alkaa suorittaa tilanteen korjauksen genomin puolesta. Se tuottaa mm CKI p21 synteesiä ja kertymää. Tämä taas puolestaan aiheuttaa Cdk 2 inhibition , jolloin Gas1- faasi pääse viime tipassa pysähtymään. Samalla kuitenkin korjaussysteemi yrittää korjata DNA:ta ja Gap1 faasi voi pitkittyä pitkäksi. Jos korjausjärjestelmän ( DNA Repair Enzymes) entsyymit onnistuvat , ATM geenituote inaktivoidaan ja solusykli saa luvan siirtyä progressioon, kun p21 estäjä on degradoitu, hajoittunut.

Mutta entä jos korjausentsyymit eivät ajoissa onnistu? p53 aiheuttaa lopulta, että solu painuu kohti apoptoosia jarrutilastaan. Solu ei voi esimerkiksi ”palata takaisin ja yrittää olla G0, lepotilasolu”. Takaisin paluuta ei ole, mutta apoptoosi mahdollisuus, täyshäviäminen on. Väärää DNA - materiaalia terve solu ei säästä. Hypoksia ja solustressi

myös aktivoivat p53:ta. Sen mahdollisuudet toimia genomin varjelijana ovat: “cell cycle arrest, DNA-repair, senescence, apoptosis”

DNA-vaurio voinee p53.n kautta mahdollisesti myös inhiboida CAK-kompleksin, jonka pitäisi yleisesti aktivoida sykliineitä ja pitää solumoottoristoa aktiivina. Asia ei ole aivan selvä kuitenkaan. (2001).

3) Onkogeenit aiheuttavat solusykli jarruttumisen

Gap1 faasin progressio voi turvatoimena onkogeenivaikutusta vastaan - jarruttua estäen transformaatiot. Onkogeeninen aktivaatio, genotoksinen stressi ja DNA vaurio voivat aiheuttaa G1-pysähtymän p53-tien kautta, jos minkä tahansa G1-faasin progressiota aiheuttavan syytekijän pitoisuus ylittää normaalitason, sillä tämä seikka indusoi tekijän ARF.

( Alternate Reading Frame- geeni, joka sijaitsee inhibiittori INK4a geenilocuksessa.)

Kaksi geeniä INK4a-ARF locuksessa voi aktivoitua:

p16 INK4a , voi pysäyttää G1 faasin inhiboimalla “moottoria” Cyklin D- Cdk 4,6.

P19ARF taas vaikuttaa inhiboiden MDM2 modulia joka vartioi pitämällä p53- “genomin vartijaa” inaktiivina. Näin p53 pääse vapaaksi ja voi aiheuttaa apoptoosin tai G1 pysähtymän p21 CKI kehittämällä ja inhiboimalla “ moottoria” Cyklin E-Cdk2.,

joten G1-voidaan pysäyttää laajalti.

Onkogeeniaktivaatioita voi tehdä liikapitoisuudellaan esim: myc, E2F, Ras tai E1A. Ras voi “jäädä päälle”, “sustain” ja aiheuttaa hyperproliferaation signaalia, mikä herättää nuo normaalit em. inhibiittorigeenit, CKI ryhmän, ARF- tietä.

Gap1 faasin kaksi säätelyakselia

Molempien Gp1 faasin akselien tulee olla muuntuneita, jotta solu lähtee poikkeamaan normaalitieltä ja transformoitumaan.

Ensimmäinen akseli on se, mikä kulkee normaalisti täten extrasellulaaristen kasvutekijäin signaalikaskadin kautta- Cyklin D -Cdk4,6- pRb- E2F- Cyklin E-Cdk2 - Cyklin A-Cdk2. ( kuten aiemmin on kuvattu).Tässä solu siirtyy normaalisti G1 faasista S-faasiin.

Jos tässä ykkösakselissa on jokin aberraatio tai akseliin liittyvissä Cdk-inhibiittoreissa (CKI) jokin aberraatio, poikkeama, saattaa käynnistyä solun kiinnittymisestä riippumaton jatkuva proliferaatio.

Toinen akseli on ATM-ATR-Chk2-p19ARF-MDM2-p53-p21, joka on varsinainen solun omatunto Jos tämä “omatunto”, genomin vartija, solusta sammuu, solu ei enää kykene havaitsemaan onkogeenistä aktivaatiota, jonka ensimmäisen akselin aberraatio on aiheuttanut eikä voi siirtyä puolustukselliseen yhden solun apoptoosiin.

Tällainen toisen akselin vaurioittanut solu ei myöskään kykene havaitsemaan DNA-vauriota . Se voi progredioitua läpi solu syklin, vaikka olisi vaikea-asteiseen geneettiseen poikkeamaan johtava.

S-faasi ( DNA synteesi)

S-faasin aikana solu syntetisoi DNA: nsa täydellisen kopion. Kummallakin tytärsolulla tulisi olla aivan saman sisältöinen kopio alkuperäisestä ( kaksoiskoodista). Jokainen emäs, joita on 3.2*10E9 sijoittuneena 46 kromosomin alueelle, tulee kopioida yhden ainoan kerran ja vain kerran syklin aikana. DNA-synteesi on täten hyvin tiukasti säädeltyä. Emäslukumäärä numerona on 3 200 000 000.

Koska joka molekyylillä on tilavuutensa ja välimatkansa, voidaan teoriassa laskea kehon kaikkien kromatidien antaman geneettisen informaation ”sanoman” konkreettinen pituus.130 kertaa maan ja auringon välinen matka ( Per Arne Aas)

Lisensöity DNA

On tehty tutkimus, jossa on yhdistetty fuusiolla G1 ja S-faasissa olleet solut. Tästä on alkanut liian varhainen DNA-replikaatio. Kun on yhdistetty fuusiolla S- ja G2 vaiheen solut, Gas2 faasi jarruttuu, kunnes S-faasi on toteuttanut DNA-kahdentamisen

On päätelty, että replikaatio voi tapahtua vain solun ollessa G1 tai S-tilassa. Tästä pääteltiin, että DNA on jollain tavalla lisensöityä, oikeutettua replikoimaan jollain hekellä ja toisella hetkellä se ei saa replikoitua. Havaittiin,. että jos pieni osa DNA:ta replikoituu, se menettää uudelleen kahdentumismahdollisuutensa ja on molekulaarisesti merkattu,” matkalippu leimattu”.

DNA-replikaatio starttaa ORC-proteiinien sitoutumiskohdista (ORC, Origin of Replication Complex). Nämä ORC-proteiinit ovat sitoutuneena DNA:han koko syklin ajan. Useita synteesissä välttämättömiä proteiineja alkaa kiinnittyä ORC-kohtaan myöhäis M- vaiheessa ja varhais-G1 vaiheessa. Näin muodostuu ” pre-RC”, pre-Replication Complex. Samalla DNA saa luvan replikoitua, se on “lisensöity DNA” .(licenced for replication). Lupa ei kuitenkaan aloita replikaatiota, vaan G1- ja S- faasin vaihtumiskohdassa lisätään viimeiset välttämättömät tekijät, jotta pre-RC muuttuu IC:ksi, ( Initiation Complex) aloituskompleksiksi. Sitten kuitenkin moni komponenteista irrotetaan (“matkalipun leimaksi” jo ennen matkaa) ja lopulta jää aloituskohtaan jäljelle, post-RP, post-replication Complex muistuttamaan aloituskohdasta. Se ei voi sykäyttää toista kierrosta alkamaan, vaan sen on “ ostettava uusi lippu” eli jälleen muututtava seuraavan syklin G1- faasissa pre-RC-muotoon.

ORC –proteiinien kompleksista

(OriC, Origin of Replication Complex).

Tämä kohta sijaitsee AT-rikastuneella alueella.

Proteiinikompleksi on sitoutuneena DNA:han koko solusyklin ajan ja määrittää DNA- replikaation aloituskohdan. Replikaatio alkaa kohdasta molempiin suuntiin ja replikoituneet DNA:t kohtaavat toisensa tietyistä kohdissa ja yhdistyvät entsyymein.

Ihmisellä on ainakin hsOrc2, hsOrc3, hsOrc4. Ihmisen ORC-sijaintikohdilta puuttuu tähän asti havaitsemattomat keskinäiset yhtenevät sekvenssit, joten järjestelmä ei ole aivan tunnettu. Epigeneettisillä tekijöillä voi olla merkitys ORC-kohtien sijoittumisessa ihmisellä.

MITOOSIN jälkeen DNA siirtyy Post-RC-tilasta (“Unlicenced DNA”) pre-.RC kuntoon (Licenced DNA”) G1 faasin kuluessa.

ORC on eräänlainen laiturijärjestelmä seuraaville proteiineille: Cdt1, Cdc6, Noc3p , joita latautuu ORC-kohtaan, kun Cdk-aktiviteetti alkaa vaimeta M-faasin sykliini-B:n hajotessa myöhäismitoosissa

( 1996-2002).

Tärkeä lisenssitavara Cdk1 on tiukasti kiinni geminiini-nimisessä tekijässä S-faasin ja G2-faasin aikana, joten se ei voi sitoutua ORC-kohtaan. Vasta varhais G1-vaiheessa se on ORC-kohdassa.

Sitten kun Cdt1, Cdc6 ja Noc3 sijaitsevat ORC-kohdassa ( On vielä kyseessä “ unlicenced DNA”) , pystyy seuraava proteiini liittymään: Mcm2-7 proteiinit.

Kun ne ovat latautuneet DNA:han, on DNA vihdoin lisensöity jälleen ja saanut luvan replikoitua : ” Licensed DNA”.

Tästä tilasta:”Lupa replikoitua” ( Pre-RC) , on siirryttävä tilaan ” valmis alkamaan replikoitumisenn”( Initiating Complex IC ) ja siitä tilaan ” alkaa replikoitua” ( Firing initiation complex). Sykliini E- hääriäi tässä pre-replikatiovaiheessa.

Kun Sykliini A- pitoisuus alkaa nousta S-faasin alussa, sen aktivoituminen ( Cyclin A- Cdk2) fosforyloi ja poistaa ORC-asemasta Cdc6 ja cdt1 molekyylit. (” leimaa matkalipun”, antaa merkin että yksi ainoa replikointoikeus on alettu käyttää). Samalla sykliini-CDK kompleksi aktivoi erään kinaasin, (Dbf4p-Cdc7p kompleksin), joka sitoo modulin Cdc45 tälle ORC-alueelle saman aikaisesti kuin myös RP-A:n ( replikaatioproteiinin A)., mistä seuraa DNA:n oikeneminen. DNA-kohta nimeltä dbp11 lataa itseensä DNA-polymeraaseja, jotka Cdc45 myös aktivoi. Kun DNA-polymeraasit on ladattu paikoilleen, alkaa nopea toiminta ( ”firing”) alkukohdasta kumpaankin suuntaan. UUSI dna kutoutuu suoraa, jatkuvana, kohti aukenevaa haarukkaa ja fragmentteina toiseen suuntaan toisessa haarassa , joka tulee samalla esiin haarukasta. Eri polymeraasit ovat toimimassa näissä eri puolissa.

(Oikaisuvaihe: valmisteluun kuuluu, että DNA-template- kohta oikenee ja DNA-ketjutkin oikenevat. Samalla myös primer aktivoituu ja pystyy sitten alkupurkamaan jostakin DNA-helixin kuin tiukasta sauvasta, että saadaan aikaan haaraa, jossa DNA-polymeraasit voivat toimia, ikäänkuin ”korjaamalla” aukipingoitetun halkaistun pajunvitsan sisäpintoja uudella energiakuorella. Toinen entsyymi tekee uutta kuorta suoraa heti aukenevaan haarukkaan päin ja toinen entsyymi tekee ”peitelappuja”, sitä mukaa kun toista DNA haaraa tulee esiin ja sitten myöhemmin ne palaset entsymaattiseti yhdistetään samanlaiseksi DNA kuoriketjuksi ja täten on sähköisen nopeasti peitetty sopivilla anti-molekyyleillä esiin paljastuneet DNA molekyylit (kuin kaksois DNA:n ”sisälmysosa”- ja samalla on tullut ”kaksi uutta pajunoksaa”

Jos esiin tulee A, sitä vastaan noudetaan T- molekyyli, jos esiin tulee C sitä vastaan noudetaan G-molekyyli. Noudetut molekyylit liitetään peräkanaa jonoon ja jonot menevät toisensa täydentäen vastakkain. kun ne vain voivat- Kun synteesin sählä ohittuu-,DNA-juosteet heti menevät vastakkain pyrkien kiemurampaan, jolloin niiden energiatila on taas stabiilimpi ja rakenne pysyvämpi, kovalenttinen. DNA ominaisuus on olla kaksoishelix kromatidissa, joka on kiemurainen. Liika vyyhtiytymistä koettaa eräät kromatidi renkaat estää. Polymeraasit ovat tarkkoja ja tuntevat, jos on avoin DNA-pää ja osaavat laittaa oikean molekyylin siihen. Johtava ( leading strand) uusi DNA-rakentuma, rakentuu heti kohti avautuvaa haarukkaa, ettei jää ” sisälmykset paljaaksi”. Pätkittäin kehittyvä on ”, ns. Okazaki-fragmentteina transkriboituva ”lagging strand”, viipyvä juoste: pätkät heti peittävät toista näkyviin tulevaa ” sisäpintaa” ja muodostuvat tasapainottamaan energeettistä jännitystilaa. Ja myöhemmin DNA-ligaasi yhdistää ne lyhempinä tehdyt paikkalaput. Että uudet kromatidit eivät aivan sotkeutuisi keskenään, niihin on Gap1 vaiheessa kehittynyt eräänlaisia sormuksen tapaisia renkaita DNA:n ymparille ( Cohesin). Kun DNA kaksinkertaistuu se tapahtuu näitten harvassa olevien single chain- renkaitten sisällä.Mutta määrätyssä hetkessä myöhemmin olisi liika toisiinsa liittyminen haitaksi, ja sen takia kohesiivinen rengassysteemi joudutaan poistamaan osittain ennen mitoosin päättymistä. Tämä Cohesin omaa funktiotaan G1-, S- ja G2- vaiheissa.

( Myöhemmin vyyhdin estäjien, cohesiinien sijaan tulee M-faasissa Condensin, joka rypistää pakaten pitkiä kromatideja, lenkeille ja täten tiivistää ja fiksoi kutakin kromatidia ja samalla sisarkromatidit pääsevät eroon toisistaan,vain välttämätön keskinen kiinnekohda-kohesiini kinetoforissa säilytetään metafaasia varten. Mutta kondensiinin teho voi ilmetä vasta sitten kun esiintyy syklin B, M-faasissa.)

DNA-replikaation organisaatiosta

Ihmisen solu voisi teoriassa suoriutua Initiation Complex ( IC) –hetkestä replikaatiohaarukan kiitävään täydentämiseen tunnissa, mutta S-faasin täydelleen suorittamiseen menee todellisuudessa 6-8 tuntia kaikissa imettäväissoluissa. Arvellaan että viive johtuu siitä, että kaikki ” IC firing” ei tapahdu samalla hetkellä. Sen sijaan havaitaan replikaatio yksiköitä, joihin kuuluu 60-80 lähekkäistä IC, jotka toimivat samanaikaisesti. Peräkkäisissä solujoukoissa tämä replikaatioyksikköjen toiminta on samankaltaista. S-faasin alkuosissa replikaatioyksiköt transkriptionaalisti aktiiveissa soluissa alkavat ensiksi toimia ja jos kromatiini on tiiviimpää ja sisältää hiljentyneitä geenejä, replikaatio tapahtuukin S-faasin myöhäisessä vaiheessa.Tämä DNA-replikaation järjestäytyminen ” tärkeysjärjestykseen” tai ”asian aktuaalisuusjärjestykseen”, antaa mahdollisuudet identifioida Brdu ( bromodeoxyuridiini)- värjäystekniikalla solujen varhainen, keski- ja myöhäinen S-faasi..

DNA-syntesin ylläpito ( Sustaining DNA-synthesis)

Tarvitaan sykliini A-Cdk2 aktiviteettia, että DNA-synteesi pysyy käynnissä.

IC ( Initiation Complex) vaati myös tätä ”A- moottoria” starttimoottoriksikin synteesille, kuten edellä mainittu. Cyklin A-Cdk2-aktiviteetti on tarpeen täydelliseen DNA-replikaation.

Jos on tapahtunut kaksoishelixvaurio (DSB), kuten jonisaatio voi aiheuttaa.

ATM-geeni voi havaita vaurion S-faasissakin samalla tavalla kuin G1-faasissa.

(Aiempi teksti: ”Gap1faasi Jonisoivan säteilyn aiheuttaman ” double strand break”-vaurion havaitsee geenituote ATM. Se aktivoituu ja fosforyloi Chk1, Chk2(Cds1) ja p53. jne”)

S-faasin aikana tapahtuva jarrutus

Miten DNA-vaurio sammuttaa ”moottorin” , joka pitää yllä DNA-( sustain) synteesiä:

Chk1 ja Chk2 fosforylaatiot johtavat Cdc25-proteiinin fosforylaatioon ja täten tapahtuu Cdc25A- priming degradaation päin.

Cdc25 taas on sellainen fosfataasi, jota tarvitaan, jotta CykliiniA-Cdk2 voisi pysyä aktiivina. Jos nyt tämä ”moottori A” sammuu, on DNA-vaurio pystynyt ATM-geenin kautta pysäyttämään solusyklin S-faasissa.

Näitä Chk1 ja Chk-2-välitteisiä mekanismeja kutsutaan S-faasin checkpoint- kohdiksi. .

Gap2-faasi

G2 faasissa DNA on jo valmista tuotetta, valmiiksi kahdennettua. Vaikka se onkin valmista, ei ole vielä mikään kiire mennä Mitoosiin( M-faasiin) ja jakamaan tuotetta, vaan DNA viihtyy 1-2 tuntia tässä valmistumisen jälkeisessä ”transithallissa” tullauksessa. Itse asiassa se on tullut viimeistelytarkistukseen ja saa odottaa lausuntoa ” Koko DNA on tullut kopioiduksi täydellisesti ja vaikuttaa hyvältä”. Tämän arvion jälkeen vasta se on vapaa lähtemään mitoosiin ja täten tasapuolisesti kahteen eri soluun jaettavaksi.

Moottorit , jotka ovat käyttäneet G1 loppuvaihetta , S-vaihetta - ja alkuvaihetta G2, ovat kinaasi Cdk2-osasta riippuvia. Myöhemmässä osassa G2 vaihetta kuitenkin vaihdetaan ”moottoriosaa” ja valitaan Cdk1. Sitä varten tarvitaan toinen sykliini, joka aktivoidaan ja tuotetaan tumaan: cykliini B. Kun nämä kohtaavat ja muodostuu (Cyklin B- Cdk1 kompleksi), uusi aktiivi ”moottori” vaikuttaa siirtymän M-faasiin, mitoosiin. Edellisen moottorin aktiviteetti täytyy samalla sammuttaa.

Entä DNA-vaurion havaitseminen G2-faasissa?

Mekanismit ovat samoja kuin G1 ja S-faasissa. Kohde on nyt ”moottori” Cyklin B-Cdk1 (eikä syklin E- tai A – Cdk2). Tähän pääsee sekä transkriptiosta riippuvaa, että siitä riippumatonta tietä. Transkriptiosta riippuva tie on välttämätön, jos pitää aikaansaada pysyvä ( sustain) G2-blokki. Transkriptiosta riippumaton tie DNA-vauriovasteessa on paljon nopeampi, mutta ei pidä blokkia jatkuvasti yllä.

Transkriptiosta riippuvan G2 –blokin aikaansaaminen

Myös G2- faasissa toimii ATM-ATR- p53 aktivaatio ( Cdk1 ja Cdk2 aktivaatiot). Cykliini B geenin ja Cdk1 geenin jarrutus saadaan.

Sen lisäksi p53 (” genomin suojelija”) voi aktivoida proteiineja jotka jarruttavat aktiivin ”moottorin” sykliini B-Cdk1 kompleksin. Sellainen proteiini on cdk inhibiittori CKI p21., joka sitoutuu tähän ” moottoriin” ja tekee sen inaktiiviksi. ja proteiini 14-3-3 sigma, joka ankkuroi Cdk1:n sytoplasmaan ja proteiini Gadd45, joka voi irrottaa sykliini B:n kinaasistaan Cdk1.

Transkriptiosta riippumattoman G2-blokin aikaansaaminen:

Cykliini B-Cdk1-kompleksin inaktiivina pitäminen G2 faasin aikana tapahtuu seuraavasti: Myt1 ja Wee1 kinaasit suorittavat inaktivoivaa fosforylaatiota ( liikafosforylaatiota)

Cdc25-fosfataasiperhe voi kuitenkin defosforyloida ja aktivoida sen

” moottorin” takaisin.

(Chk 1 ja 2 voivat fosforyloida cdc25- fosfataasiperhettä)

Ihmisellä tavataan kolme eri Cdc25-jäsentä. Cdc25A ( G1 ja S-faaseissa toimiva), Cdc25B ja Cdc25C, jotka säätelevät mitoosin siirryttäessä ja voivat edistää mitoosia.

Jos Cdc25C fosforyloituu, sen sakkaa 14-3-3- proteiiniperhe.

Täten ATM ,ATR aktivaatio johtaen Chk1-Chk2 aktivaation, inaktivoi cdc25 ( fosfataaseja) ja aiheuttaa inaktivoivan hyperfosforyloitumisen Cdk1-kinaasissa Wee1 ja Myt1 kautta.

”Moottori” Sykliini B-Cdk1 tulee inaktiiviksi ja jää sytosoliin, samalla solusykli jarruttuu G2-vaiheeseen.

Epätäydellisesti replikoituneen DNA:n paljastaminen

Chk1 ja Chk 2 pystyvät reagoimaan replikoitumattoman DNA.n olemassa oloon. Kun sitten ne aktivoituvat, G2 jarruttuu samalla tavalla kuin DNA-vauriossa .(kts. transkriptiosta riippumaton tie)

M-faasi

Solu siirtyy sitten interfaasistaan mitoosifaasin.

Mitoosi on solun syklin dramaattisin vaihe ja aiemmin sitä katseltiin mikroskoopilla ja pystyttiin silmällä erottamaan erilaisia alavaiheita, jotka nimettiin seuraavasti jo viime vuosisadalla: Profaasi, prometafaasi, metafaasi, anafaas, telofaasi.

Profaasi Sentrosomit alkavat tehdä mitoosisukkulaa, jossa on mikrotubuluksia ja DNA alkaa kondensoitua ( näyttää tiivistyvän)

Prometafaasi Tuman kalvo särkyy ensin. Kromosomit pääsevät liittymään mikrotubluksiin kinetoforeillaan ja näyttävät liikkuvan.

Metafaasi: Kromosomit ovat puolitiessä ” metafaasi levyssä ” poolien välillä tasaisesti.

Anafaasi: Sisarkromatidit erkanevat ja alkavat vetäytyä pooleja kohden.

Telofaasi Kromatidien 2 joukkoa ovat saapuneet eri pooleihin ja uusi tumakalvo on muodostunt niitten ympärille. On kaksi täysin erillistä kromatidisettiä.

Lopuksi myös tuman ympärillä ollut sytosoli alkaa jakautua kahden

tytärsolun kesken : Cytokinesis. Tietystikin sytoplasma -anti on erilainen esim mitokondrioitten osalta, eikä molemmille sama. Mitokondriassa on oma mtDNA lisäten geneettiseen variaatioon panoksensa. Mitokondria voi olla esim evolutionaalinen bakteeri.

Varhaisimmassa M-faasissa tarvitaan vielä cykliini A-vaikutusta. Mutta pääsykliini M faasissa on sykliini B ja se liittyneenä Cdk1-kinaasiinsa ( cdc2 on sen toinen nmi) Kun tätä on muodostunut, se fosforyloi tuman kelmun, joka pirstoutuu, koska se on tuma- lamiinia.

Samalla se kondensoi , tiivistää, tihentää, kromatidit ja vaikuttaa niitten asettumista metafaasitasoon. Mutta sykliini B:n tulee hajota, että kromosomit pääsevät eteenpäin metafaasilevystä anafaasijaksoon ( erkanemaan). Vasta kun ” moottori”, Cyklin B -Cdk1 on tehty inaktiiviksi, kromosomit migroituvat pooleihinsa ja solu jakaantuu kahtia ( telofaasi).

Miten solu valmistautuu jakautumaan Gap2 faasissa, interfadsissa)?

Cohesin; Condensin; Securin -Separin , Separin

INTERFAASI Jotta solu voisi tuottaa kaksi identtistä tytärsolua, interfaasissa pitää kromatidien olla tiiviisti lähekkäin.

GAP1. Jo Gap1 vaiheessa Cohesiini lisättiin kromatideihin ( ne sormuksen omaiset renkaat joiden sisällä sitten replikaatio tapahtuu ).( Vv 2002-2003).

Cohesin - kompleksin pääkomponentti on Scc1, scc3,Smc1, Smc3 ( sc = single chain -asia ).

GAP2 loppuvaihe: Siinä vaiheessa kun solun on mentävä mitoosiin, kaikki Cohesiini, joka sijaitsee muualla kuin kinetoforikohdalla, korvautuu Condensiinilla, joka pitää yksittäistä kromatidialankaa rypyssä ja koossa eri kohdistaan, mutta ei yhdistä enää kahta vierekkäistä sisarkromatideja.

MITOOSI. Vasta metafaasi-anafaasivaihteessa viimeinenkin Cohesiini-yhteys katkaistaan separaasilla. Separiini ei voi tehdä tuota erotusta aiemmin, koska securiini pitää sitä inaktiivina.

Aktiivi APC taas antaa merkin , että securiini ja sykliini B saa hajota ( ubikitinoitua ja hävitä) (APC on anaphase promoting complex)

M-faasin vaiheista

Profaasi

Miten tapahtuu mitoosin ( M-faasin) ensimmäisen askeleen molekulaarinen säätyminen?

Vasta valmistunut ” moottori”, (sykliini B-Cdk1 kompleksi) varmistaa, että siirtymä on irreversibeli, yksisuuntainen ja fosforyloi cdc25 jäsenet.(jotka ovat M-faasiin siirtymisen säätelijät). Näin cdc25B ja cdc25C estovaikutus moottoriin vähenee, seuraa positiivinen feed back ja vahvennettu ”moottoriaktivaatio” siirtää solun interfaasista mitoosiin.

Cykliini B-Cdk1 aktivoi myös polaarikinaasin, Plk. Plk lisää cdc25 inaktivaatiota vahvistaen positiivista feed back-lenkkiä. Plk rekryteeraa gamma-tubuliinia ja aktivoi Asp

Sentrosomi

Asp sijaitse sentrosomissa ja auttaa mikrotubulusten miinus-pään löytämisessä. Aktiivi Plk on tärkeä bipolaarisen sukkulan muodostuksessa varhaisessa mitoosissa.

Aktivoitu Plk poistaa Cohesin – molekyylit muualta paitsi kinetochoreista, jotka pitävät sisarkromosomeja yhdessä ( 2002). Kinetokoreista sisarkromatidit eriävät vasta metafaasin lopulla. Condensiini puolestaan liittyy saman kromatidilangan kahteen eri kohtaan, tekee ”ryppylankaa”, lenkkejä ( v 2003). ”Moottori”, sykliini B-cdk1 profaasin aikana vaikuttaa Condensiinin avulla kromosomien tiivistymisen.

Prometafaasi

Tumakalvo muodostuu lipidien kaksoiskerroksesta, jota tukee tuma lamina, proteiiniverkosto. Tumalevy, lamina, sisältää laminiini proteiini perheen, joka voi tulla cykliini B-Cdk1-kompleksin fosforyloimaksi. Tämä fosforylaatio hajoittaa tuma laminan. Ja niin tumakalvo liukenee ja tässä hetkessä solusykli siirtyy prometafaasiin.

Prometafaasin molekulaariset tapahtumat:

Nyt mikrotubulukset pääsevät paremmin ulottumaan kromosomien kinetoforeihin Niissä oleva HsEg5- moottoriproteiini fosforyloituu ja aktivoituu, eräänlainen kiteytymisen tapainen järjestäytyminen tapahtuu. Tässä on aktivaattorina myös ”mitoosimoottori” sykliin B-Cdk1.

Prometafaasin, metafaasin ja anafaasin aikana tarvitaan sitä vetovoimaa kromosomien kinetoforin ja mikrotubulusjärjestelmän kesken.

Vain kinetoforissa oleva cohesiini on kaikesta cohesiinista jäljellä ja vielä pitää sisarkromosomeja yhdessä kun samalla alkaa mikrotubulusten taholta vetovoima kohistua positiivisiin kromosomeihin negatiivisista pooleista.

Separaasi voi pilkkoa tuon Cohesinin Scc1 komponentin, mutta mitoosimoottori sykliini B-cdk1 inaktivoi sitä fosforyloimalla. Lisäksi securiini peittää separiinin prometafaasissa, joten se ei voi tehdä mitään.. Sillä hetkellä kun separaasi on toimintakykyinen, sisarkromosomit eroavat toisistaan ( viimeinen cohesin irtoaa)( 2001).

Miten metafaasi havaitsee väärinasettuneet kromosomit?

Metafaasissa kromosomit ovat asettuneet mitoosisukkulan keskivaihelle, ekvaattoritasoon, metafaasilevyyn. Sisarkromosomit ovat vielä liittyneet toisiinsa, mutta niihin vaikuttaa myös mikrotubulusten taholta poolien suuntaan vetovoimaa. On tensiotila, elektrinen poolisuus ainakin aluksi osana.. Tässä solun on tehtävä ”checkpoint” kontrolli amfiteelisen liittymän laadusta: kromosomien sisarkromatidien riittävä liittymä ja mikrotubuluksiin suuntautuva liittymä täydellisenä ovat välttämättömyys Muussa tapauksessa separaasin aktivoituminen voisi aiheuttaa non-disjunction, koska yksi tai useampi kromosomi voisi lähteä kokonaisuudessaan vain toiseen pooliin päin. Toiseen tytärsoluun tulisi liikaa ja toiseen liian vähän kromosomaalista materiaalia. Onnistunut amfiteelinen liittyminen ( amphitelic attachment) johtaa tensioon, tarpeelliseen jännitteen nousuun molempien sisarkromatidien kinetokorien välillä . Niinkin pieni tension puute, kuin yhden kromatidin tension puute, johtaa metafaasin pysähtymään (1995). On tieteellisen keskustelun kohteena, miten voisi havaita tension molekulaarisen mekanismin ( 2003).

Miten metafaasi voi pysähtyä?

On havaittu, että tarvitsee olla eräät geenit, jotta voi tapahtua metafaasin jarruttuma (geenit Mad1-3, Bub1, Bub3, BubR1). Geenituotteet lokalisoituvat sellaiseen kinetokoriin, joka ei ole tehnyt kunnon liittymää. Tension puutteessa Bub1 ja BubR1 aiheuttavat, että Mad2 sakkaa cdc20:tä. Kun Mad2 on sitoutunut cdc20:een, estyy anafaasi. (APC;C).

Anafaasi

Anafaasin alkaminen APC; C aktivaatiolla. ( APC,C, Anaphase promoting Complex, Cyclosome).

Heti kun “ metafaasin tullikontrolli” antaa tiedon, että amfiteelinen liittymä, alkuasento solugenomin jakoon, on täydellisen onnistunutta, poistuu Bub-Mad- välitteinen estäjävaikutus APC;C- aktivaattorilta.

Tämä APC: C puolestaan on ubikitiiniligaasi, jonka kohdemolekyyleinä on “mitoosimoottori” cykliini B-cdk1 ja kromatidejä erottamaan alkavan järjestelmän jarrumolekyyli securiini.

Ubikitinoiminen

taas leimaa solusyklin proteiinit “roskakoppaan” menevien joukkoon, tarkoittaa “ delete”, “poistettavia tekijöitä”. Tässä moniaskelisesa prosessissa ubikitiiniketju liitetään proteiiniin. .Tämä ubikitiinista johtuva proteiinien hajoittaminen on keskeinen seikka solusyklissä säätelemässä solusyklin progressiota, koska sen kautta sykliinit, inhibiittoriet ja näitten aktivaattorit pilkotaan erittäin säädellysti

Heti kun moottori Cykliini B-cdk1 ja securiini on hävitetty, separaasi aktivoituu. Se leikkaa katki jäljellä olevan cohesiinin ja anafaasi alkaa, kun kromatidit (+) alkavat migroitua vastapäisiin pooleihin (-) mikrotubulusten, mitoottisen sukkulan, avulla.

Telofaasi ja sytokineesi seuraavat sykliini B:n puutteesta.

Koska nyt sykliini B vähenee, tuma lamina voi muodostua jälleen, kun sitä ei enää fosforyloida. hajalle. Nyt muodostuu kaksi tumakelmua kahden muodostuneen kromosomijoukon ympärille ( automaattisesti) Samalla tiiveystila kromatideista alkaa hervota, kun sykliini B vähenee. Kromatidit rentoutuvat.

Sykliini B-cdk1 on ollut estämässä myös sytosolin puolella tapahtumia. Sen vähetessä sytosoli tulee liikkuvammaksi ja jakaantuu kahden tytärsolun kesken. Kun solu on täysin jakaantunut. molemmat tytärsolut siirtyvät omaan G1 vaiheeseensa kumpikin.

Centrosomin syklin osuus

Centrosomi on mikrotubulukset organisoiva keskus.

(Jollain tavalla mitokondria on kuin soluun sopeutunut bakteeri ja sentrosomi kuin tumaan sopeutunut virustähde, minimaalisin DNA , joka aikanaan on tullut aikojen alkusoluun alan kompassina)

Centrosomi omaa mini DNA:n Sen täytyy myös kaksinkertaistua.

Centrosomi DNA kaksinkertaistuu synkronisesti solusyklin suhteen. Sekin saa luvan kaksinkertaistua vain yhden kerran täydellisesti.

Gap1 pm vaihe: On vain yksi sentrosomi, jossa on sisällä lähekkäin oleva sentriolipari.

Gap1 ps vaiheessa, kun esiintyy sykliini E-Cdk2-aktiviteetin -vaikutusta, sentriolit alkavat karkottaa toisiaan sentrosomin sisässä, ne polarisoituvat. Negatiivistä sähköä.

S-faasissa , kun on SykliiniA-Cdk2 vaikutusta, sentriolit duplikoituvat.

G2-faasissa duplikoituneet sentriolit kypsyvät koon puolesta, mutta pysyvät sentrosomin sisässä.

Kun solu siirtyy M-faasiin, sentrosomi jakautuu ja sentriolit ottavat tähtimäisen muodon sojottaen mikrotubuluksia joka suuntaan, mutta positiivinen solukeskus attrahoi negatiivista sentriolia kinetokorillaan.

Näin solun jakautuessa kumpikin tytärsolu saa yhden tähden, sentrosomin, jonka sisällä on 2 sentriolia aktivoituna toisiaan karkottavia, negatiivisen latauksen saaneita.

Entä jos sentrosomeissa on poikkeavuuksia?

Poikkeava poolimäärä.

Solut, joissa on poikkeava lukumäärä sentrosomeja, omaavat kromatidien erottamisvaikeuksia mitoosissa, jolloin genomimassa tulee epätasaisesti jaetuksi.

Monissa aneuploidisissa tuumoreissa on tavattu vakava kromosomipoikkeama, jossa on mahdollisesti syynä , että DNA on tehnyt endoreplikaation , kaksi replikaatiota ilman mitoosia välillä, koska on poikkeava määrä pooleja.

Sen takia sentrosomin syklin normaali säätyminen on olennaista geneettisen stabiliteetin ylläpidossa.

Solusykli ja syöpä

Ensiksi keksityt onkogeenit olivat geenit, jotka koodasivat signaalitransduktiota tekeviä proteiineja ( Ras, Myc, Raf).

Nyt tiedetään, että syövän takana on geneettinen instabiliteetti, joka syntyy vain silloin, kun solusykli on mennyt epäkuntoon, eikä ole niinkään signaalikaskadiperäinen asia.

Geneettinen instabiliteetti ja syöpä

Maligni solu löytää nopeasti uusia piirteitä, kuten kyvyn mennä basaalilaminan läpi, invasoitua. ympäristöön, mennä verenkiertoon, palata kudokseen verenkierrosta, kyvyn kasvaa missä tahansa kehossa eikä vain originaalielimessä, kyvyn indusoida endoteelia valmistamaan itselleen tarvittavaa uutta verisuonitusta tuumorin kasvaneeseen energiantarpeeseen, kyvyn muuttua terapiaresistentiksi.

Vahvasti aneuploidit kasvaimet, joissa on paljon aberranttia geneettistä materiaalia, progredioituvat nopeammin ja isäntäletaalimmin kuin diploidit tuumorit. Geneettisen instabiliteetin molekyyliperustan selvittely onkin tärkeä etsittäessä terapiamahdollisuuksia.

Syy lisääntyvään geneettiseen instabiliteettiin?

Korjaussysteemissään puutteellinen solu ei korjaa DNA vaurioita eikä replikaatiovirheitään kunnolla ja siksi kehittyy lukuisia pistemutaatioita.

Vahvoja anomalioita karyotyypissä esiintyy, kun solu ei voi säilyttää integriteettiään tai kromosomilukuaan, esim sentrosomi duplikaatti on ollut virheellinen, sisarkromatidikoheesio on irronnut liian varhain tai endoreplikaatio on tapahtunut. Lisäksi ne solut, joilla on hidas progressio replikaatiotapahtumassa, saavat helpommin geeniamplifikaatioita tai deleetioita. Eri tuumoreilla on eri tyyppisiä geneettisiä vaurioita. Jopa tuumorit, jotka lähtevät samasta kudostyypistä eivät käytä samaa solusyklidefektiä tai osoita samaa DNA korjausdefektia

Geneettisen vaurion havaitseminen

Vaikka geneettisen instabiliteetin takana olevat tekijät ovat erilaisia tuumorista tumoriin, kaikkien tuumorisolujen täytyy olla puutteellisiä havaintokyvyltään geneettisen vaurion suhteen tai kyvyltään reagoida oikein geneettiseen vaurioon.

Hyvin usein muuntuneissa soluissa on ne kaksi solusäätelyn akselia, jotka aiemmin on mainittu, ( kuten esim ATM, ATR, Chk2- MDM2- p53-p21 tie) muuntuneita.

Geeni p53 (Guardian of the genome) on kaikkein yleisimmin muuntunut geeni ihmisen solideissa tuumoreissa, ainakin 50 prosentissa näistä tuumoreista.

Sykliini A ja Sykliini E syövässä

Nämä sykliinit omaavat olennaisen tärkeän osan DNA- synteesissä. Arvellaan molemmilla olevan osuutta myös sentrosomin elämänsyklin säätelyssä. Megakaryoblasteissa aiheuttaa sykliini A ja akkumulaatio endoreplikaatiota. Jos näitä sykliineitä esiintyy väärässä vaiheessa solusykliä, ne voivat aiheuttaa geneettistä instabiliteettia.

( Sykliini ja sentrosomiteoria on vuoden 2002 - 2003 englantilaisissa oppikirjoissa).

Tutkijan tutkimustyön puoleen en tässä muistiinpanossa puutu, vaan

suomennan ja kommentoin tätä taustatietoa. Tarvitse kerrata näitä asioita. .

Syöpäsäätiö kustansi tutkimuksen

2004-11-23 suomennettua