Kahvitauko

“Coffee break”

Kahvin molekyylit ovat kun valkuaisainekatabolian lopputuotteita puriinilinjasta. Miten ne vaikuttavat DNA:korjausmekanismeihin?

Onko se genomille vaarallinen?

Caffeine impairs resection during DNA break repair by reducing the levels of nucleases Sae2 and Dna2

Michael Tsabar Vinay V. Eapen Jennifer M. Mason Gonen Memisoglu David P. Waterman Marcus J. Long Douglas K. Bishop James E. Haber

Nucleic Acids Research, Volume 43, Issue 14, 18 August 2015, Pages 6889–6901, https://doi.org/10.1093/nar/gkv520

Published:

27 May 2015

Article history Abstract

Suomennosta:

Vasteen kromosomin kaksoiskatkoille eukaryoottiset solut aktivoivat DNA-vauriontarkistuskohdan, jossa toimii yhteistyössä PI3-kinaasin kaltaiset proteiinikinaasis ATR ja ATM ( hiivassa Mec1 ja Tel1). Sen jälkeen kun kaksoiskatko on muodostunut Mec1 ja Tel1 fosforyloivat histonin H2A seriinin 129 joka tunnetaan gamma-H2AX- nimisenä. Tutkijat käyttivät kaffeiinia inhiboimaan tarkistuskohtakinaaseja DSB-induktion jälkeen. He osoittivat, että pitkittynyt H2A-S129 fosforylaatio ei vaadi jatkuvaa Mec1 ja Tel1- aktiivisuutta.

Odottamaton löytö kaffeiinin käytöstä oli huonontunut HR , homologinen rekombinaatio johtuen 5´ -3´ pääteresektion estymisestä riippumatta Mec1 ja Tel1 inhibitiosta. Kahvikäsittely johti kahden nukleaasin nopeaan hajoittumiseen proteosomisilppurissa. Toinen näistä oli nukleaasi Sae2, joka omaa osan resektion varhaisvaiheessa ja toinen oli nukleaasi Dna2, jonka tehtävä on nopeuttaa tiusta kahdesta laajasta resektiotiestä. Sae2-instabiliteetti on ilmeistä, kun ei ole DNA vauriota. Samankaltainen Sae2-kato tapahtuu sykloheximidivaikutuksesta. Kaffeiinikäsittelyllä on samanlaista vaikutusta säteilytettyihin HeLa-soluihin, joissa se blokeerasi RPA muodostumisen ja Rad51-fokukset, jotka riippuvat 5´- 3´-resektiosta, trimmauksesta, katkenneissa kromosomipäädyissä. Löydöistä tulee oivallusta kaffeiinin käyttöön DNA-vaurion++ herkistävänä agenssina syöpäsoluissa.

• I response to chromosomal double-strand breaks (DSBs), eukaryoticcells activate the DNA damage checkpoint, which is orchestrated by the PI3 kinase-like protein kinases ATR and ATM (Mec1 and Tel1 in budding yeast). Following DSB formation, Mec1 and Tel1 phosphorylate histone H2A on serine 129 (known as γ-H2AX). We used caffeine to inhibit the checkpoint kinases after DSB induction. We show that prolonged phosphorylation of H2A-S129 does not require continuous Mec1 and Tel1 activity. Unexpectedly, caffeine treatment impaired homologous recombination by inhibiting 5′ to 3′ end resection, independent of Mec1 and Tel1 inhibition. Caffeine treatment led to the rapid loss, by proteasomal degradation, of both Sae2, a nuclease that plays a role in early steps of resection, and Dna2, a nuclease that facilitates one of two extensive resection pathways. Sae2's instability is evident in the absence of DNA damage. A similar loss is seen when protein synthesis is inhibited by cycloheximide. Caffeine treatment had similar effects on irradiated HeLa cells, blocking the formation of RPA and Rad51 foci that depend on 5′ to 3′ resection of broken chromosome ends. Our findings provide insight toward the use of caffeine as a DNA damage-sensitizing agent in cancer cells.

Issue Section:

Genome integrity, repair and replication

Johdannon suomennosta

INTRODUCTION

DNA kaksoiskatkokset ovat hyvin vahingollisia tapahtumia, jotka voivat johtaa kromosomipoikkevuuksiin, solukuolemaan ja syöpään. Kromosomikatokejn korjaus tapahtuu useilla hyvin konservoiduilla teillä. G1 faasin solut ensisijaisesti korjaavat kaksoiskatkon liittämällä uudelleen katkenneet päät ei-homologisella päätteitten liitännällä (NHEJ) . Kun solut ovat ohittaneet “starttikohdan” matkallaan S-faasin alkuun, korjauksen päätie vaihtuu homologiseksi rekombinaatioksi HR. Aloitusvaihe ja olennainen askel HR-tiessä on dsDNA:n 5´- 3´-resektio kaksoiskatkon päädyissä, trimmaus, mistä jää trimmattuna jäljelle yksisäikeisiä 3´ päätyjä (ssDNA) Näyttö sekä in vivo että in vitro viittaa siihen, että resektioN alkaa MRX-kompleksi Mre11-Rad50-Xrs2 yhdessä Sae2 nukleaasin kanssa;  kasvavassa hiivassa homologi on CtIP.

Sae2 on havaittu in vitro-tutkimuksessa nopeuttamassa 5´- 3´ resektiota edistämällä Mre11:n endonukleaasiaktiivisuutta, vaikka oletetaan Sae2:lla itsellään olevan nukleaasiaktiivisuutta. Laajempi resektio riippuu kahdesta eri nukleaasiaktiivisuudesta: toinen käsittää Exo1 ja toinen osallistuva on kompleksi, jossa on Dna2, Sgs1, Top3 ja Rmi1.YksisäikeiEnn DNA-häntä, joka muodostuu resektiolla on ensin replikaatioproteiini A:n peittämä (RPA) ja se tekee interaktion Rad52:n kanssa nopeuttaen Rad51-rekombinaatioproteiinifilamentin muodostumista. Rad51- filamentti katalysoi ssDNA:lle homologisten sekvenssien etsintää läpi genomin ja edistää säikeen invasoitumista ssDNA:n ja homologisen dsDNA:n välissä. Säieinvaasiota seuraa DNA-synteesin aloitus invAsoituvan säikeen 3´-päädystä ja mahdollisesti DSB korjaantuu.

• DNA double strand breaks (DSBs) are highly deleterious events that may lead to chromosomal abnormalities, cell death and cancer. Repair of chromosome breaks occurs by several highly conserved pathways. G1 cells predominantly repair DSBs by re-joining the broken ends through nonhomologous end-joining (NHEJ) pathways (1,2). After the cells pass ‘start’ on their way to initiate S phase, the main pathway of repair shifts to homologous recombination (HR) (2–4). An initial and essential step in HR is the 5′ to 3′ resection of the dsDNA at the DSB end, which leaves 3′ single-stranded DNA (ssDNA) tails. Both in vivo and in vitro evidence suggests that resection is initiated by the Mre11-Rad50-Xrs2 complex (MRX) together with Sae2, the budding yeast homolog of CtIP (5–8). Recently, Sae2 has been shown in vitro to facilitate 5′ to 3′ resection by promoting the endonuclease activity of Mre11 (9), although Sae2 itself has been suggested to have nuclease activity (10). More extensive resection depends on two separate nuclease activities, one involving Exo1 and another involving a complex containing Dna2, Sgs1, Top3 and Rmi1 (6,7,11,12). The ssDNA tail created by resection is first coated by replication protein A (RPA) that interacts with Rad52 to facilitate the formation of a filament of the Rad51 recombination protein (13–15). The Rad51 filament catalyzes a search throughout the genome for sequences homologous to the ssDNA within the filament and promotes strand invasion between the ssDNA and homologous double-stranded DNA (dsDNA). Strand invasion is followed by the initiation of DNA synthesis from the 3′ end of the invading strand and eventual repair of the DSB (16,17).

Kun tapahtuu kaksoiskatko (DSB) sekvensseissä, joilla on molemmissä katkospäädyissä homologiaa templaatin sekvenssin kanssa (sisarkromatidi, jokin homologi kromosomi tai ektooppinen donori), korjaantuminen tapahtuu geenikonversiolla (GC). Jos vain toinen pääty kykeenee pariutumaan homologisiin sekvensseihin, korjaantuminen ediStyy rekombinaatiosta riippuvalla prosessilla, joka on katkoksen indusoimaa replikaatiota (BIR). Korjaantuminen voi tapahtua myös Rad51:stä riippumattomalla tavalla myöstäämällä yksittäistä DNA-säiettä (SSA, single strands annealing), jos on kaksoiskatkoksen sivuilla homologisia sekvenssejä.

• When the DSB occurs in sequences that share homology on both ends of the break with a template sequence (a sister chromatid, a homologous chromosome or an ectopic donor) repair occurs by gene conversion (GC). If only one end of the DSB is capable of pairing with homologous sequences, repair proceeds by a recombination-dependent process termed break-induced replication (BIR) (18,19). Repair can also occur in a Rad51-independent fashion by single-strand annealing (SSA) when there are homologous sequences flanking a DSB (20).

Jotta korjaantumiseen saa riittävästi aikaa ja mitoosi estyisi murtuneen kromosomin läsnäollessa, solut aktivoivat DNA-vaurion tarkistuskohdan. Kaksi tarkistuskohdan PI3-kinaasin kaltaista proteiinikinaasia ,ATM ja ATR (Tel1 ja Mec1 hiivassa) rekrytoituvat kaksoiskatkoon (DSB) ja fosforyloivat alavirran effektorien kaskadin, mikä estää soluja jakaantumasta kunnes vaurio on korjattu. Silmukoivassa hiivassa tukiproteiini Rad9 rekrytoituu kaksoiskatkoon ja siinä fosforyloituu Mec1:n toimesta. Rad9 välittää sitten Rad53 (Chk2) ja Chk1-proteiinien autofosforyloitumisen. Rad9 fosforyloi Cdc20 ja inhiboi sen (APC-aktivaattorin, anafaasia edistävän kompleksin aktivaattorin) Tämä inhibitio Chk1:n aktivaation ohella stabilisoi Pds1:n, sekuriinin, ja estää mitoosin. Kun korjaus on tehty valmiiksi, DNA-vaurion tarkistuskohta menee off-tilaan ja sallii solujen ryhtyä jälleen solusyklin progressioon ja tämä on toipumista, recovery. Jos vauriota ei pystytä korjaamaan, solut voivat mahdollisesti asettaa tarkistuskohdan OFF- tilaan adaptaatioprosessillla.

• In order to allow sufficient time for repair, and to prevent mitosis in the presence of a broken chromosome, cells activate the DNA damage checkpoint. Two checkpoint PI3 kinase-like protein kinases, ATM and ATR (Tel1 and Mec1 in yeast, respectively), are recruited to the DSB and phosphorylate a cascade of downstream effectors that, in turn, prevent the cells from dividing until the damage is repaired (21–24). In budding yeast, the scaffolding protein Rad9 is recruited to the DSB, where it is phosphorylated by Mec1 (24). Rad9 then mediates the autophosphorylation of Rad53 (Chk2) and Chk1 (22,25). Rad53 phosphorylates and inhibits Cdc20, an activator of the anaphase-promoting complex. This inhibition, along with activation of Chk1, stabilizes Pds1 (securin) and prevents mitosis (22,26). After repair is complete, the DNA damage checkpoint is turned off to allow the cells to resume cell cycle progression, a process termed recovery. If the damage cannot be repaired, the cells can eventually turn off the checkpoint by a process termed adaptation (27,28).

Toinen Mec1 ja Tel1-kinaasien aktiivisuuden kohde on histonin H2Aseriini129. Tämä modifikaatio, gamma-H2AX on evolutionaalisesti konservoitunut. ATM ja ATR voivat nopeasti fosforyloida imettäväisen HsAX-S139 seriinin vasteena DNA-vaurioon. Modifikaatio leviää 100 kb:n mitan DSB-vaurion ympärillä hiivasoluissa ja 1Mb imettäväissolun DSB-vaurion ympärillä ja se toimii korjaustekijöiden rekrytoimisessa DSB.vaurion läheisyyteen. Jos soluista puuttuu kyky fosforyloida H2A-S129 (H2A-S129A), ne adaptoituvat luonnollista solua nopeammin, mikä viittaa siihen, että tällä modifikaatiolla on merkitystä jarruttuman keston pituudelle. Yllättävää kyllä on että histonia H2A-S129A ilmentävät histonit omaavat 5´-3´- resektiotahdin DSB-päädyissä , mikä on suurempi kuin luonnonsoluissa (6,8 kb/h versus 4 kb/h), mikä viittaa taas siihen että enempi ssDNA tai resektiosivutuotteiden määrä ei sinänsä tai itsestään signaloi tarkistuskohdan ylläpitoa. Gamma-H2AX hiivassa on nopeasti poistunut korjaukseen jälkeen kromatiinista vielä tuntemattoman faktorin toimesta ja sitten defosforyloituu PP4 fosfataasikompleksilla.

• Another target of Mec1 and Tel1 kinase activity is serine 129 of histone H2A. This modification, termed γ-H2AX, is evolutionarily conserved; ATM and ATR rapidly phosphorylate mammalian H2AX-S139 in response to DNA damage (29–32). The modification spreads as far as 100 kb around the DSB in yeast cells, and 1 Mb around a DSB in mammalian cells, and serves to recruit repair factors to the vicinity of the DSB (29,31,33). Cells that lack the ability to phosphorylate H2A-S129 (H2A-S129A) adapt faster than WT cells, suggesting this modification plays a role in determining the length hiivaof arrest (34,35). Surprisingly, cells expressing histone H2A-S129A have a rate of 5′ to 3′ resection of the DSB ends greater than that in WT cells (6.8 kb/h versus 4 kb/h), which implies that having more ssDNA or more resection byproducts does not, in and of itself, signal for checkpoint maintenance (36,37). γ-H2AX in yeast is rapidly removed from chromatin after repair by a yet unknown factor and then dephosphorylated by the PP4 phosphatase complex (38).

Kysymys on, onko Mec1 ja Tel1 konstitutiivisesti vaadittu pitämään yllä gamma-H2AX:ta sen muodostumisen jälkeen. Tutkijat käyttivät kaffeiinia estämään Mec1 ja Tel1 nukleaasit sen jälkeen kun gamma-H2AX oli muodostunut. Kaffeiini toimi PI3K-inhibiittorina ja sen on osoitettu inhiboivan ATM ja ATR imettäväissoluissa ja kahdessa hiivassa.Tutkijat havaitsivat,että gamma-H2AX jää pysyttelemään DSB:n ympärillä kaffeiinikäsittelyn jälkeen, mikä viittaa siihen, että modifikaatio on stabiili eikä riipu jatkuvasta Mec1/Tel1-aktiivisuudesta.

• Here we asked if Mec1 and Tel1 are constitutively required to maintain γ-H2AX after its formation. We used caffeine to inhibit Mec1 and Tel1 after the formation of γ-H2AX. Caffeine acts as a PI3K inhibitor and has been shown to inhibit ATM and ATR in mammalian cells, Schizosacchromyces pombe and Saccharomyces cerevisiae (39–45). We find that γ-H2AX is retained around a DSB after caffeine treatment indicating that the modification is stable, and does not depend on continuous Mec1/Tel1 activity.

Imettäväissoluissa tuumorisuppressori p53 aktivoituu DNA-vaurion jälkeen G1 faasissa ja pitää yllä vahvaa G1-tarkistuskohtaa. Päinvastoin S-faasin ja G2/M- tarkistuskohta ovat täysin riippuvaisia ATM:stä ja ATR:stä, eivätkä tarvitse p53:a. Todellakin kaffeiinikäsittely osoittautui sensitoivan p53- vajeiset tuumorisolut jonisoivalle säteilylle.Tämän vaikutuksen oletettiin tapahtuvan kaffeiinivälitteisein G2/M-tarkistuskohdan eston takia. Kuitenkaan kaffeiini ei pystynyt enempää säteilyherkistämään imettäväis- tai DT-40-soluja, joista HR puuttui- tämä viittaisi siihen, että herkistysmekanismi käsittäisi pikemminkin HR-inhibition kuin tarkistuskohdan kontrollin inhibition. Tuore tutkimus osoitti, että kaffeiinilla käsittely osallistui imettäväisten Rad51- välitteisen linkkimolekyylin muodostamiseen in vitro ja geenikohdennuksessa in vivo.

• In mammalian cells, the tumor suppressor p53 becomes active following DNA damage in the G1 phase, and maintains a robust G1 checkpoint (46). In contrast, the S phase and G2/M checkpoints are completely dependent on ATM and ATR, and do not require p53 (46). Indeed, caffeine treatment was shown to sensitize p53-deficient tumor cells to ionizing irradiation. This effect was hypothesized to occur due to the caffeine-mediated inhibition of the G2/M checkpoint (47–49). However, caffeine could not further radiosensitize both mammalian and DT-40 cells that are deficient for HR, suggesting that the mechanism of sensitization involves inhibition of HR rather than checkpoint control (50–52). A recent study showed that caffeine treatment interferes with mammalian Rad51-mediated joint molecule formation in vitro as well as gene targeting in vivo (53).

Tässä tutkijat osoittivat, että kaffeiini heikentää kasvassa hiivassa ja Hela soluissa resektiota (trimmausta) . He osoittivat kasvavalla hiivalla, että HR-inhibitiota tapahtuu riippumatta DNA-vauriotarkistuskohdan inhibitiosta korjauksen ensimmäiseen vaiheeseen puuttumalla. Resektion (trimmauksen) huonontuminen korreloi Sae2 ja Dna2 nukleaasien runsauden vähentymään kaffeiinikäsitelyn jälkeen. Tutkijat osoittavat, että molemmat nukleaasit kohdentuvat proteosomisilppuriin hajoittumaan. Erityissti he osoittavat, että Sae2 on epävakaa proteiini, koska se hajoaa nopeasti kaffeiinista tai sykloheximidistä (CHX)- silloinkin kun DNA-vauriota ei ole. Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen,
 että kaffeiinikäsittely kohdentaa homologisen rekombinaation (HR) varhaisimpiin vaiheisiin riippumatta sen ATM/ATR-inhibitiosta.

• Here we show that caffeine treatment impairs resection in budding yeast and HeLa cells. We show in budding yeast that inhibition of homologous recombination occurs independently of inhibition of the DNA damage checkpoint, by interfering with the first step in repair: resection of the DSB ends. The impairment of resection correlates with a reduction in the abundance of both Sae2 and Dna2 following caffeine treatment. We show that both nucleases are targeted for proteasomal degradation. In particular, we show that Sae2 is an unstable protein, as it is degraded rapidly following caffeine or cycloheximide (CHX) treatment even in the absence of DNA damage. Taken together, these data suggest that caffeine treatment targets one of the earliest steps in HR, independent of its inhibition of ATM/ATR.

(14) SIRT6 histonimodifioijana ja SNFH2 kromatiinin muokkaajana

SNF2H=SMARCA5, SWI/SNF related , matrix associated actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 5. Synonyms: hISWI, hSNF2H, ISWI, SNF2H, WCRF135,

Crosstalk between SIRT6 as histone modifier and SNF2H a chromatin remodeler.
Page 1755
Käännös seuraa myöh,

BRG1 = SMARCA4 , inaktivoitunut tuumreissa.  Säätää päälle ZNF185 tuumorisuppressoria. 

(13) SIRT1 ja SIRT6 funktionaalisessa suhteessa PARP1:een (2014 Vaquero)

 Laia Bosch-Preseque and Aljandro Vaquero. Sirtuin-dependent epigenetic regualtion in the maintennce of genome integrity(2014) s. 1754-5.
 Suomennosta.
Poly(ADP-riboosi)polymeraasi 1 PARP1 on PARP-superperheen jäsen. Sitä ilmenee yleisesti ja se vastaa useimmista polyADPribosylaatioista kehoproteiineissa.Itseasiassa histonien ja muiden tumaproteiinien  polyADPribosylaatio on tärkeimpiä mekanismeja, jotka kontrolloivat kromatiinin rakennetta ja integriteettiä, kun on kyse DNA-vauriovasteesta. Eräät tutkijat ehdottavat, että polyADPribosylaatio saattaisi olla kriittinen kromatiinidynamiikan epigeneettisessä säädössä. PARP1 ja sen sukulainen PARP2 ovat tärkeitä ylläpitämässä konstitutiivista ja fakultatiivista heterokromatiinia, niiden integriteettiä.  Molemmat proteiinit lokalisoituvat telomeereihin, sentromeereihin ja rDNA:han, jossa ne tekevät interaktion spesifisten partnereitten kanssa. ja säätelevät niitä.
Sirtuiinit ja PARPit ovat kaikkein tehokkaimmin NAD+koentsyymiä konsumoivia entsyymeitä.  Eipä ole yllättävää, että jotkut tutkimukset ovat selvittäneet näiden kahden entsyymiperheen jäsenen välisiä funktionaalisia vuorovaikutuksia.On kehitetty  eläin- ja solumalleja SIRT1:n ja PARP1:n koordinoitujen funktioiden tutkimiseen konstitutiivisessa heterkoromatiinissa. Hiiressä molemman geenin poistaminen johtaa myöhäispostnataalin kuolleisuuden kohoamiseen,koska genominen epävakaus lisääntyy, mikä viittaa kummankin geenin tärkeyteen genomin integriteetin ylläpidossa kehityksen aikana.  Päinvastoin SIRT-/- hiirellä PRP1 poistogeenisyys reversoi  kromatiinipoikkeavuuden fenotyypin, joka liittyi SIRT1:n menetykseen. Tiedemiesten mukaan tämä löytö viittaa molempien proteiinien tärkeään osaan kromatiinistruktuurin ja funktion  säädössä-jossain määrin. Siitä huolimatta tarvitaan lisätutkimuksia näiden kahden proteiinin välisen funktionaalisen linkin selvittämiseksi ja selventämään  niiden vastaavat aktiivisuudet heterkromatiinin säädössä.

Kiinnostava huomio on, että stressinalaisessa tilassaSIRT1 edistää solun elossapysymistä deasetyloimalla PARP1:n ( joka johtaa kohti apoptoosia DNA-vauriosta). Itseasiassa SIRT1:stä riippuva deasetylaatio blokeeraa PARP1-aktiivisuuden ja suojaa soluja PARP1-välitteiseltä kuolemalta.

Lisähuomiona SIRT1-vajeiset solut osoittavat lisääntynyttä DNA-vauriota, jonka indusoi PARP1-aktiivisuus ja lisääntynyt apoptoosia indusoivan faktorin  välittämä solukuolema.
On jotain näyttöä funnktionaalisesta linkisstä  näiden kahden NAD+-koentsyymiä konsumoivan  entsyymin  välillä solun DNA-vauriovasteessa ja genomisen integriteetin ylläpidossa.  Tämä on toinen alue,joka kaipaa lisätutkimuksia tulevaisuudessa.

SIRT6 on toinen sirtuiini, joka on linkkiytynyt PARP1-aktiivisuuteen ja se sirtuiini,joka on eniten osallistunut ssDNA-nauhan katkeaman ja DNA:n kaksoiskatkoksen korjausmekanismiin.
Kiintoisa havainto on,että SIRT6-vajeisilla hiirillä on  instabiili genomi.
Oksidatiivisessa stressissä SIRT6 rekrytoituu DNA-vauriokohtiin ja stimuloi korjausta  tekemöllö suoran interaktion PARP1:n kanssa  ja tekemällä ADP-ribosylaation  lysiiniin 521, mikä osallistuu BER- DNA-korjausmekanismiin (Base excision repair)  ja DSB-signalointiin.

(12) Sirtuiinit ja histoniasetyylitransferaasien säätely. p300, hMOF, TIP60 (Vaquero 2014)

Reference: Sirtuins and regulation of histone acetyl transferases; p300. Page 1753-4.
Sirtuin‐dependent epigenetic regulation in the maintenance of genome integrity

Laia Bosch‐Presegué, Alejandro Vaquero; https://doi.org/10.1111/febs.13053

SIRTUIINIT ( deasetylaasit),   histonideasetylaasit HDAC ja histoniasetylaasit HAT  p300, hMOF ja TIP60.

Kiintoisaa on, että sirtuiinit kohdentavat niihin entsyymeihin, jotka  niiden kanssa ko-operaatiossa säätelevät kromatiinia, myös omien antagonistientsyymiensä  kanssa;  sellaisia ovat histoniasetyylitransferaasit (HATs).Tämän kaltaiset interaktiot  mahdollisesti vaikuttavat solun tarpeen vaatiessa (esim stressin alaisena)  antamien vasteiden tehokkaaseen hienosäätöön.

SIRT1 ja p300

Esimerkiksi sirtuiinit säätelevät p300:a joka on histoniasetyylitransferaasi, eräs tärkeä transkriptionaalinen aktivaattori, jota esiintyy yleisesti ja jota tarvitaan soluprosesseihin; kasvuun, erilaistumiseen ja elossapysymiseen.

P300 HAT aktivaation lisäksi autoasetyloituu ja asetyloi useita ei-histoniproteiineja, p53, c-myc, HMG-proteiinit ja tumareseptoreita. P300 autoasetylaatio indusoi rakenteen muutoksen, joka on kriittinen transitiossa kromatiinimodifikaation ja VP16- välitteisen preinitiaatiokompleksin (PIC) kokoontumisen kesken. Tässä mielessä tiukka p300 funktion kontrolli on kriittinen varmistamassa näiden teiden säätelyn ja ylläpitämässa heterokromatiinistruktuuria. Sirt1 näyttää tekevän interaktion p300:n kanssa ja vaimentaa sen transaktivaation ja tämä repressio vaatii NAD+ riippuvaista SIRT1-asetylaasiaktiivisuutta ja se asetyloi lysiinin eli k1020 ja K1024 lysiinit p300:n CRD1-transkriptionaalisessa repressiodomeenissa. Ottaen huomioon miten tärkeä p300 on rajoittavana transkriptionaalisena k-faktorina, sen d-asetylaatio ja repressio SIRT1:n toimesta voisi olla ratkaiseva metabolian ja soludifferentiaation aikaisten erilaisten teiden säätelyille.

SIRT2ja p300.
Päinvastoin (in vitro) SIRT2 on ainoa sirtuiini, joka voi deasetyloida autoasetyloituneen p300:n. Edelleen eräässä solututkimuksessa RNAi välitteinen depleetio tai SIRT2:n kemiallinen inhibitio lisäsivät Ac-p300:n - pitoisuuksia ja indusoi geenireportterin aktivaation. Vastakkaisista tuloksista hulimatta on paljon näyttöä joka viittaa p300:n käyvän läpi dynaamista asetylaation ja deasetylaation sykliä joka säätelee tiukasti sen aktiivisuuden.

SIRT1 ja MYST-perheenjäsenet hMOF ja TIP60

SIRTUIINIT on liitetty myös MYST-perheenjäsenten histoniasetylaation säätelyyn. Nykyään tiedetään kahden MYST- perheenjäsen , MOF ja TIP60, olevan SIRT1:n substraatteja.

Histoniasetylaasi MOF  oma kriittisen osan trankription amtivaatiossa ja imettäväisissä se on pääasiallinen HAT hsitonille H4K16Ac. Ihmisortologi hMOF autoasetyloituu konservatiivisesä MYST-domenissa (C2H2 Zn finger ja HAT) in vitro ja in vivo..
SIRT1:n on havaittu tekevän interaktion tämän domeenin kanssa ja deasetyloivan sen.Tämä deasetylaatio saattaa avustaa MIF:ia sitoutumaan kromatiiniin, mikä heijatuu siitä, että hMOF asetyloitumattomana  sitoutuu vahvasti nukleosomeihin, mutta jos se on asetyloituneena,
sen sitoutuminen heikentyy. Johdonmukaista näiden löytöjen knssa SIRT1:n yliesiintymässä hMOF:in rekrytointi kromatiiniin lisääntyy
SIRT1 poistogeenisyys vähentää MOF-rekrytointia kohdegeenille HOXA9, mihin liittyy  geenin vaimentunut transkriptio ja alentuneet H4K16Ac-pitoisuudet.
Aikuisen hematopoieettisesta kantasolusta HSC ja progeniittorisolusta on taas päinvastoin kuvattu, että SIRT1 voi sitoutua suoran HOXA9 geeniin ja deasetyloida H4K16 ja edistää polycomb-spesifistä repressiivistä histonimodifikaatiota. On näyttöä SIRT1:n kaksoisvaikutuksesta geenin ilmenemään H4K16:n säätelyn kautta.

TIP60 on toinen histoniasetylaasi,johon SIRT1 kohdentaa . TIP60 on MYST-perheenjäsen.
TIP60 asetyloi monia substraatteja, joihin kuuluu histoneja ja p53, ja niin se edistää UV-säteilyn jälkeistä apoptoosia. TIP60 autoasetyloituu primäärivastena DNA-vaurioon, mikä on sen aktivaation ylintä säätöä, ja asetyloi DNA-vauriolle spesifisen histonin H2A-variantin, H2AX, eräässä prosssissa,joka on tarpeen DNA-vauriovasteessa.
Lisäksi SIRT1 on tunnistettu TIP60:n fysikaalisna interaktiopartnerina ja tietojen mukaan SIRT1 deasetyloi spesifisesti TIP60:n DNA-vauriovasteena ja stimuloi sen proteosomaalista hajoitamista ubikitinaatiolla in vivo.
Lisäksi tiedetään,että  SIRT1 depleetio RNA-interferensillä aiheuttaa H2AX-hyperasetylaation ja lisää  MDC1,BRCA1 ja Rad51-kertymiä tunafokuksiin.  Tämänmukaisesti SIRT1 omaa osaa  DSB.signaloinnissa,johon osallistuu hMOF ja TIP60.

Stressittömässä tilassa SIRT1 sitoutuu hMOF:iin   ja TIP60::een niiden entsymaattiseen domeeniin ja deasetyloi ne estäen  entsymaattiset aktiivisuudet ja edistäen niiden ubikitinoitumista ja proteosomaalista hajoitusta. Kuitenkin DNA-vaurio johtaa SIRT1:n  alentuneeseen sitoutumiseen hMOF:iin ja TIP60:een, mikä taas johtaa kummankin MYST-perheenjsenen hyperasetylaatioon ja DNA-vauriosignaalin aktivoitumiseen.Neljän tunnin kuluttua DNA vaurion alkamisesta SIRT1 asosioituu uudestaan kumpaankin MYST-perheenjäseneeseen palauttaen niiden deasetylaatiotilat ja sen takia ehkäisten liian apoptoosin.

SIRT1-hMOF/TIP60-interaktiot ja hMOF/TIP60-asetylaatiostatus näyttävät olevan mitä suurimmasa määrin DNAvauriosignaalien kontrolloimia, ja ne pitävät yllä hMOF:n ja TIP60:n kriittisiä pitoisuuksia DNA-korjauksen aikana.

Kaiken kaikkiaan nämä löydöt viittaavat siihen, että SIRT1 saattaisi vaimentaa liiallista DNA-vauriovastetta vaimentamalla hMOF- ja TIP60-funktioita.

(11) SIRT1 ja DNA-metylaatio DNMT1. entsyymillä, (Vaquero 2014)

https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/febs.13053#febs13053-bib-0011 s. 1754-5)

Sirtuins at the crossroads of stemness, aging, and cancer

Carol O'Callaghan

Athanassios Vassilopoulos

First published: 10 October 2017

https://doi.org/10.1111/acel.12685

SIRT1 and DNA methylation

 Suomennosta.

Sirtuiini1 ja DNA-metylaatio (käännös sivuilta 1754-5) 

DNA-metyylitransferaasit lisäävät metyyliryhmiä 5`-asemaan CpG-dinukleotidien sytidiinitähteisiin-CpG-saarekkeiden metylaatio johtaa repressiokompleksien rekrytoitumiseen ja transkriptiotekijöiden alentuneeseen sitoutumiseen. Tämän takia aktiivisti transkriboitu DNA on hypometyloitua, kun taas hiljennetty DNA on hypermetyloitua.

Imettäväisgenomi sisältää kolme DNMT- eli DNA-metyylitransferaasiproteiinia.

De novo-metylaatioista vastaa DNMT3a ja DNMT3B ja ne modifioivat metyloitumatonta DNA:ta. Metylaatioitten ylläpidosta taas huolehtii DNMT1. Se tunnistettiin ensimmäisenä ja se on näistä kolmesta runsainta ja yleisintä. Se on ratkaisevinta tuumorisuppressorigeenien hiljentämisessä ja solun elossapysymisessä. 

DNMT1 siis metyloi DNA:ta. Sen lisäksi se myös vaimentaa transkriptiota ja mekanismina on rekrytoida DNA:lle transkriptiokorepressori DNMT1:een assosioituva proteiini1, HDAC1, HDAC2 ja metyyli-CpG:tä sitova proteiini. Tälla tavalla on SIRT1-sirtuiini ja histonideasetylaatioaktiivisuus linkkiytynyt DNMT1:n suorittamaan DNA-metylaatioon useissa genomisissa kohdissa kuten tumajyväsen rDNA:ssa ja tietyissä tuumorisuppressiogeeneissä. Tämän takia nähdään SIRT1 sijoittautuneena usean poikkeavasti hiljentyneen tuumorisuppressiogeenin promoottoriin, jossa esiintyy niitä hypermetyloituneita 5´CpG-saarekkeita - mutta ei  kuitenkaan vastaaviin promoottoreihin niissä solulinjoissa, joiden geenit eivät ole hypermetyloituneessa tilassa.

Jos ihmissolusta poistetaan (depletoidaan) DNMT1, niissä ilmenee DNA-metylaation puutetta ja kohonneita histoni H4K16Ac-pitoisuuksia rRNA-geeneissä. DNMT1 tekee interaktion sirtuiini SIRT1:n kanssa ja rekrytoi sen rRNA-geeneille,mikä viittaa siihen, että DNMT1 on kriittisen tärkeä tumajyväsen ( nukleolus).

Tutkijat ovat osoittaneet, että DNMT1- entsyymin posttranslationaaliset modifikaatiot ( kuten asetylaatio, sumoylaatio, fosforylaatio, metylaatio, ubikitinaatio) saattaisivat korreloida sen katalyyttisen aktiivisuuden muutoksiin, DNA:ta sitovaan aktiivisuuteen ja stabiliteettiin.

Mielenkiintoista on, että sen N- ja C-terminaalisten alueiden 12 lysiiniä (K) ovat asetyloituneina ja deasetyloivaksi entsyymiksi on tunnistettu SIRT1 sekä in vivo että in vitro. Lisäksi DNMT1:n asetylaatiot ja deasetylaatiot pystyvät muuntamaan sen entsymaattista aktiivisuutta, kapasiteettia hiljentää tuumorisuppressiogeenejä ja kykyä säädellä solusykliä.

DNMT1 ja DNMT3B ovat osana hiljentävää kompleksia,jossa on jäseninä PRC4, EZH2 ja SIRT1. Oksidatiivisen stressin aikana muodostuu tätä kompleksia ja jatkossa se translokoituu niiltä alueilta, joissa ei ole runsaasti GC:tä alueille. joissa on runsaasti GC:tä.

 PRC4 =Polycomb repressive complex 4.

 Eräässä in vivo-koliittimallissa havaittiin geenipromoottoreilla samankaltaista rikastumaa. Tutkijoiden mukaan sellainen rikastuma saattaisi selittää syöpäspesifisen poikkeavan DNA-metylaation ja transkriptionaalisen hiljentymän, mikä heidän mallissaan oli havaittavissa.

Kaikenkaikkiaan nämä löydöt heijastavat merkitsevää funktionaalista suhdetta DNA-metyylitransferaasien (DNMT) ja sirtuiinien (SIRT) kesken.

Suomennos kappaleesta SIRT1 and DNA methylation.

Page 1754-5. In: Sirtuin- dependent epigenetic regulation in the maintenance of genomic integrity.

Laia Bosch-Presegue´ et Alejandro Vaquero(2014).

(10) DNAvaurio ja SIRT6 rekrytoituu

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276513004759

 

(9) SIRT7 ja rDNA säätely. SIRT1 ja SIRT7 vastavaikutus tässä säätelyssä (Vaquero 2014)

https://www.researchgate.net/figure/Opposing-functions-of-SIRT1-and-SIRT7-in-rDNA-transcription-Both-SIRT1-and-SIRT7-are_fig5_256490320

( Löysin netistä  tämän kuvan avuksi tähän alla olevaan käännökseen sirtuiinista SIRT7 )

https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/febs.13053#febs13053-bib-0011

Sirtuins at the crossroads of stemness, aging, and cancer

Carol O'Callaghan

Athanassios Vassilopoulos

First published: 10 October 2017

https://doi.org/10.1111/acel.12685

Sirtuiini SIRT7 ja ribosomaalisen DNA:n (rDNA) säätely   (Sivu 1755) 

 

SIRT7 on primääristi deasetylaasi ja se sijaitsee tumajyväsessä, nukleolus, ja tumassa, nukleus . Tumajyväsessä se säätelee ribosomaalisen DNA:n geeni-ilmenemää aktivoimalla polymeraasi I:n (Pol I) , vaikkakin sen spesifinen kohde on tuntematon.

Näillä linjoilla tutkijat ovat raportoineet, että SIRT7:n vähentäminen johtaa alentuneeseen RNA polymeraasi-I:n assosioitumiseen rDNA:n kanssa, mikä taas vuorostaan aiheuttaa alentunutta Pol I-transkriptiota . Lisäksi  massapektrometriset tutkimukset ovat varmistaneet SIRT7:n muodostavan osan kompleksista, joka sisältää myös kromatiinia uudelleen muovaavan kompleksin B-WICH, UBF ja PolI ja viittaa siihen, että SIRT7 nopeuttaa rDNA-transkriptiota tekemällä vuorovaikutuksen B-WICH:n kanssa.

 Ottaen huomioon, että rRNA-transkriptiotasot muuntuvat tietyn tyyppisissä stresseissä kuten genotoksisessa stressissä tai kalorirajoituksessa, niin SIRT7:n funktio voisi olla stressisensorin tavoin kriittinen tumajyväsen säätelylle.

 Lisäksi SIRT7 fosforyloituu mitoosin aikana, kun se lokalisoituu kromosomeihin telofaasiin asti, jolla kohdalla se sitten defosforyloituu ja aktivoituu varsinaisen rDNA:n uudelleen ilmentämiseen mitoosin jälkeen.

 Mielenkiintonen seikka on että SIRT1 voi vaimentaa RNA Pol I deasetyloimalla kompleksissa olevan  TAF_I68- komponentin

• SIRT7 and rDNA regulation

• SIRT7 is primarily a deacetylase and is localized to the nucleolus and the nucleus. In the former, it regulates ribosomal DNA gene expression by activating Pol I, although its specific target is unknown 196. Along these lines, researchers have reported that depletion of SIRT7 leads to decreased association of Pol I with rDNA, which in turn causes reduced transcription of Pol I 196. Furthermore, mass spectrometry studies have confirmed that SIRT7 forms part of a complex that also contains the chromatin remodeling complex B‐WICH, UBF and Pol I, and suggest that SIRT7 facilitates transcription of rDNA by interacting with B‐WICH 197. Given that rRNA transcription levels are altered under certain types of stress (e.g. genotoxic stress or calorie restriction), the function of SIRT7 as a stress sensor could be critical for nucleolar regulation. Furthermore, SIRT7 is phosphorylated during mitosis, when it localizes with chromosomes until telophase, at which point it is dephosphorylated and becomes activated for proper rDNA re‐expression after mitosis. Interestingly, SIRT1 can repress transcription of RNA Pol I by deacetylating its component TAF_I68 196.