Tämän artikkelin tausta on suomennostani ja muistiinpanoja ja termiluetteloita Per Aas väitökirjasta,jonka aihepiirin käsitteisiin koetin perehdyttää itseäni pari kymmentä vuotta siten. N Tämä artikkeli on siis vain raakamateriaalia ja asian rakennelmaa ja siinä katson nyt muutamia yksityiskohtia kuten XRCC geenistön tänään tausta ajatuksena onkogeenit, säteilyvaikutukset, geenin korjaamiset, virusten evaasiotiet... siis asiaa hahmottavaa ja termeihin tutustumista. Käytän lisälähteenä GeneCards, josta saa geenin uusimmat löydöt ja uusimmat geenit esiin. .Ps tietty tämä on asiantuntijoista kuin katsella päältä heikoilla jäillä veteenjoutuneen yrityksiä päästä takaisin maalle...
AAS PER ARNE (NTNU 2004 Norwegian Cancer Society) Macromolecular maintenance in human cells- Repair of uracil in DNA and methylations in DNA and RNA
Kirjan korkeatasoisuudesta johtuen kirjoitan vain lähdetiedot ja perustietämystä muistiin aluksi.
Kirjoitan tähän englantilaisen sisällysluettelon ja terminologiaa asian hahmottamisen helpoittamiseksi.
Abbreviations
Introduction
Overview of DNA repair mechanism
Direct reversal
Base excision repair (BER)
(Urasil in DNA
Uracil DNA glycosylase encoded by the UNG gene. Catalytic mechanism of uracil DNA glycosylse (UNG). Structure of the UNG gene, localisation of UNG and protein:protein interaction (PPI). Regulation of UNG expression- background and some results. The role of UNG in the maturation of antibodies). (Urasiilista lähetetty pieni kommentti 15.12. 2004)
Nucleotide excision repair (NER)
Mismatch repair (MMR)
- DNA Double strand break repair (DSB)
Bypass of damage in human cells.
Transcription regulation.
Repair of alkylation damage by the human AlkB homologues - Background, some results and comments.
The Ada regulon in E.coli
Exogenous and endogenous sources of alkylation damage
-
RNA repair and quality control of RNA (Uusi sitaatti tästä blogiin 15.3. 2024)
- Normal modifications in tRNA and rRNA
- Protein repair
AAG, alkyladenine glycosylase = ANPG = MPG
AID, activation induced deaminase
AGT O-alkylguanine - DNA-transferase, AGT= AGAT= MGMT
AGAT O-alkylguanine - DNA transferase
ANPG, alkyl-B-purine glycosylase
ATM, Ataxia Teleangiectasia mutated; ATR – related
BER, base excision repair
bp, base pair
CS, Cockayne syndrome
CSR, class switch recombination
5,6- dihydrouracil
dRB, deoxyribophosphate
DSBR, double strand break repair. dsDNA, double stranded DNA
dUTPase, desoxyuridine triphosphate hydrolase
ERCC1, excision repair cross-complementing 1
EST, expressed sequence tag
FEN-1, flap endonuclease 1
5-foU 5-formyluracil; 5-FU 5 fluorouracil
GG-NER, Global Genome nucleotide excision repair
HAP1, Human AP-endonuclease
hABH1, human alkB homologue 1
hABH2, human alkB homolohgue 2
hABH3, human alkB homologue 3
HAT, histone acetyl transferase
HDAC, histone deacetylase
5-HMU 5-hydroxymethyluracil
HMT histone methyl transferase
HR, homologous recombination
kb, Kilobase; kDa kiloDalton
MBD4, methyl-binding domain protein 4
MCMT, 5 -methylcytosine methyl transferase
1-meA, 1-methyladenine; 3-meA, 3- methyladenine
3-meC, 3-methylcytosine; 5-meC, 5-methylcytosine
3-meG, 3-methylguanine; 7-meG, 7-methylguanine
MGMT, O-methylguanine-DNA-transferase
MMR, mismatch repair
MPG, methylpurine glycosylase
mRNA, messengerRNA
MUG, mismatch specific uracil-DNA glycosylase
MSI, microsatellite instability
NBS, Nijmeken breakage syndrome
NHEJ, Non -homologous end–joining
NMD, nonsence mediated decay
nt, nucleotide
2-OHA, 2-hydroxyadenine; 2-OHC 2-hydroxycytosine; 2-OHU, 2-hydroxyuracil
O-meG, O-methylguanine; O-meT, O-methylthymine; 8-oxoG, 8-oxo-7,8-dihydroguanine
PA ja PB, promoter A Promotor B
PARP, Poly(ADP-ribose) polymerase
PCNA, proliferating cell nuclear antigen
PCR, polymerase chain reaction
PTM, Post transcriptional modification
RPA, Replication protein A
SAM, S-adenosyl methionin
SHM, somatic hypermutation
SMUG-1, single-strand-selective monofunctional uracil-DNA glycosylase 1
ssBP, single strand binding protein; ssDNA, single stranded DNA
TCR, transcription coupled repair; TC-NER, TC- nucleotide excision repair
TdT, terminal deoxynucleotidyl transferase
TFIIH, transcriptionfactor II H
TTD, Tricothiodystrophia
UDG, uracil-DNA glycosylase
UNG1, mitochondrial form of uracil-DNA-glycosylase
UNG2, nuclear form of uracil-DNA-glycosylas ( urasiilin poistajat DNA:sta)
Vi, virion infectivity factor
XP, Xeroderma pigmentosum
XRCC1 ,eräs osin tuntematon proteiini, joka koordinoi BER- systeemin aktivaatioproteiineja
( alleviivattuja mainittu artikkelissa urasiilista)
DNA:ssa esiintyvät emäkset ovat : Adenine (A), thymine (T), cytosine (C) ja guanine (G)
(GG= Global Genome). Ihmisen Genomi on diploidinen ja sisältää 22 kromosomiparia ja kaksi sukupuolikromosomia, XX-pari naisilla ja XY-pari miehillä.
Solun DNA-pitoisuus: DNA pitoisuus genomissa on 3 x 10*9 bps / haploidi genomi
(Bp on base pair) . Jokaisen emäsparin välillä on 3,4 Ångströmin mitta. Joten DNA:ta on 2 metriä / diploidi genomi. Kun ihmisellä on kehossaan soluja noin 10*exp. 13, siitä seuraa, että nukleotideja on ihmisessä 3 x 10 *exp.22 eli DNA mittaa tulee 2 x 10 *exp.10 km. Se on noin 130 kertaa eäisyys auringosta maahan. Virheen mahdollisuuksien määrä on tähtitieteellinen. Joten se elämisen järki joka pakkautuu koodiin ja integroituna toteutuu siten, että tulos on ihminen, joka fungeeraa sekä yksilönä, että kehossaan että yhteiskunnassa on periaatteessa mahdottoman pitkän ja laajan selektion jokin pieni ripetulos- ja ihmiskunnan ikä, se aatamin uni voi olla vaikka miten pitkä; sitä ei ainakaan aatami ( ihminen) itse laskenut. Kehon ainoa keino välttyä liialta mutatoimiselta, on erikoistaa tärkeät solut ja pysäyttää ne G0-tilaan, mikä on parempi kuin mutaatioriski.
On olemassa järjestelmä, joka pitää G0- tilassa, joten koko genomi
ei joka hetki tuota koko matkaa, sitä 130 maan ja auringon
väliä, vaan välttämättömän, essentiellin osan siitä ja senkin
synkronisesti eri kohdissa S- faasia. Kun ajattelee DNA:n
luonnetta, että se lisääntyy uskollisesti itseään kopioimalla,
tämä asettaa soluille erittäin suuret vaatimukset, jotta noin
pitkä geneettinen informaatio voi vuodesta toiseen toistua
virheettömästi ( ja sukupolvesta toiseen elinkykyisesti). Tietysti tapahtuu mutaatioita, jotka ovat
haitallisia.Mutta on otettava huomioon mutaatioitten hyödyllisyyskin,
sillä ei ihminen niin kehuttava ole koskaan historiansa vaiheissa
ollut, etteikö jokin mutaatio sivistyksen hankkimisen
mahdollisuuksiin päin olisi suositeltava. DNA:n uusiutumisen
virheistä ja hyvistä sattumista ja johdatuksista summautuu luonnollisesti
ihmiskunnan iän rajat ja DNA:n itsensäkorjaamiskyvyn
heikentymisestä voi syntyä myös sairaustiloja kuten syöpiä, mikä on
oikeastaan vain luonnollinen tauti, koska siinä DNA vain on
häiriintynyttä- ja samalla kuitenkin voi paralleelisti ihmisessä
versoa joitain muita positiivisia geenikoodauksia esiin. Syöpä tuskin ilmenee samanaikaisesti kehon joka solussa kenelläkäämn, en tiedä jos moni spontaanisti abortoituva alkio on sellaisest syystä poistunut. On ihme kun terveitä lapsia syntyy?
Jotta noin mittavan DNA:n uusiutumiskopioinnit onnistuisivat
onnellisesti, täytyy kehon joka päivä olla ravitsemukseltaan,
hapensaanniltaan ja miljöötekijöiltään otollisessa tilassa ( jota ihmisten viisaimmat koettavat havaita antaakseen sitten ministeritason neuvoja ja suosituksia kukin kansalleen)
Tosin DNA:n kyky uusiutua on vahvempi ja DNA-elinikä olisi suurempi,
kuin erikoistuneen ihmiskehon summaelinikä voi olla elinten toisaalta välttämättömän
differentioitumisen aiheuttaman rajallisuuden takia. (DNA ehkä
voisi tuottaa 180 vuoden elinikää, mutta elinkunto rajoittaa
elinikää noin 70-80 maille Raamatun antaman tiedon mukaan. Tässä onkin tieteen haasteet!). Muuten eräs erikoinen havainto: Mooses eli 40 vuotta Egyptissä, mitä
loisteliaimmissa olosuhteissa ja kognitiivisesessa koulutuksessa. Sitten toiset 40
vuotta, mitä erilaisimmissa erämaaolosuhteissa, jossa fyysinen
panos oli merkittävä ja sitten seuraavat 40 vuotta mitä
raskaimmassa henkistä ja fyysistä työtä vaativassa
innovatiivisessa kansanjohtotehtävässä. Vuoden pituus on kyllä meidän vuoden pituutta
vastava: 120 talvea. Mahdollisesti hän eli sitä elämää mikä
vastaa ihmiskunnan parhainta resurssia pitkän ja merkityksellisen
elmän suhteen ja niin arvelee myös israelilaiset, koska joka päivä
toivotetaan onnea ad 120 vuoden ikään saakka. Asia saattaa olla
aivan realistinen. Mazal Tov Ad Mea VeEshrim!
Mistä syystä nyt 2024 otan tämän 2004 väitöskirjan sanaston esiin. Maailman eräs menossa oleva pandemia on HIV-1 pandemia. Viime aikoina on havaittu,että HIV-1 virus on kaapannut kapselirakenteeseensa dsDNA vaiheessa avustavan kehon vahvimman antioksidanttimolekyylin (IP6) , jonka avulla se pääsee immuunijärjestelmän huomaamatta tumaan ja integraasilla integroitumaan ihmisen DNA:n joukkoon. Etsin tietoa, käyttääkö se myös ihmisen DNA:n integraasia vai viraalista integraasia ainoastaan.
DNA:n korjaantuminen DNA repair
Tutkija mainitsee DNA:n korjaantumismekanismeista, jota on 5 eri ryhmää:
1. ”Direct reversal”-, jossa yksi entsyymi korjaa vaurion ilman DNA-synteesiä.
2. Base excision repair (BER)
3. Nucleotide excision repair (NER)
4. Mismatch repair (MMR)
5. Recombination repair (RR) ( mainitaan )
Eri korjausjärjestelmät antavat myös taustatukea toisilleen ( back up).
TLS. Soluilla on myös oma vaurionsietojärjestelmänsäkin polymeraasien avulla, jotka sallivat ” lesion bypass” - vaurion ohittamisen prosessissa, jota sanotaan ” translesion synthesis”(TLS). Täten tulee kuin merkki: Tämä kohta on virheellinen ja tätä ei toisteta, vaan ohitetaan.
Jos korjaamisfunktio on puutteellinen, siitä seuraa sairausoireyhtymiä ihmisellä ja tällaisia mainitaan tässä tutkimuksessa seuraavia.
Oireyhtymä Häiriintynyt mekanismi
Xeroderma pigmentosum(XP) GG-NER (TC-NER)
Cockayne syndrome TC-NER
Trichothiodystrophy GG-NER/TC-NER
Ataxia teleangiectasia DSB-response/repair; (DSB, Double strand break)
AT-like disorder DSB-response/repair
Nijmegen breakage syndrome DSB-response/repair
BRCA1/BRCA2 HR ( homologous recombination)
Werner syndrome HR?/TLS? BER?
Bloom syndrome HR?
Rothmund-Thomson syndrome HR?
Ligase IV deficiency End joining
HNPCC MMR
XP variant TLS
Hyper IgM syndrome Voi johtua UNG2 puutteesta
(UNG2= nuclear form of uracil-DNA-glykosylase, UDG)
I DNA REPAIR mechanism
Tunnetaan neljä eri ”direct reversal of damage”- korjaussysteemiä.
Tämä entsyymi siirtää metyylin tai muun yksinkertaisen alkyyliryhmän O6-alkyyliguaniinista tai O4-alkyylithymiinistä omaan cysteiiniinsä, jolloin entsyymi itse inaktivoituu vapauttaessaan nukleotidin. Tämä entsyymi luo soluissa resistenssiä Guaniinia O6-alkyloivien aineitten sytotoksisuutta vastaan. (Toisaalta solut voidaan tehdä herkiksi alkylaatiolle alentamalla tämän MGMT-entsyymin vaikutusta). Jos O6-mG ei korjaannu, seuraa ”mismatch” thymiiniin päin (T) ja silloin mismatch repair ( MMR)- systeemi triggeröityy ja apoptoosi voi seurata.
Alkyloitunut DNA voi korjautua siten että alkyyli voidaan saada irrotettua. Alfa-KG:sta ja raudasta riippuva oxygenaasi hydroxyloi DNA-emäksen alkyyliryhmän, jolloin alfa-KG muuttuu meripihkahapoksi ja alfa-KG:n C5 irtoaa hiilidioksidina Hydroksyloitu metyyli vapautuu spontaanisti formaldehydinä Tällä korjauksella irtoaisi CH3- ryhmä 1-meA.sta tai 3-meC:stä korjaten adeniinin ja cytosiinin DNA: ssa ja RNA.ssa. Tekijää tai entsyymiä sanotaan AlkB (DNA and RNA) tai hABH12 (DNA) tai hABH3 (DNA and RNA). Tämä tutkimus esitti kaavan näiden ”human Alk B homologue ” oletetusta reaktiosta..
Joka glykosylaasi on kapeaspektrinen, mutta toimii kuitenkin kattaen toisiaan, overlapping. Ihmisglykosylaaseilla on N–terminaalinen sekvenssi, joka auttaa lokalisoitumisessa ja interaktioissa. DNA-glykosylaasien tehtävänä on havaita ja poistaa sopimaton tai viallinen emäs. Se tehdään flipping- menetelmällä, jossa irronut emäs tipautetaan glykoosientsyymitaskuun tai onteloon. Jos emäs sopii siihen onteloon, se hydrolysoidaan irti N-glykosidisidoksesta emäksen ja desoxyriboosin välikohdasta.
a) Monofunktionaaliset DNA-glykosylaasit: hydroksylaaseja, jotka käyttävät aktiivia vesimolekyyliä tehden vapaan kohdan (AP-site , abasic site) AP-kohdan, johon asettuu endonukleaasi APE1.
5´-fosfodiestrisidos katkeaa sitten tällä Mg++:sta riippuvalla AP-endonukleaasilla, jolloin jää 3´-hydroksyyli- ja 5´desoksyribofosfaatti (dRP) terminaalit (3prim ja 5prim-päädyt). (APE1stimuloi Pol-beettaa excidoimaan(irrottamaan) 5´-terminaalisen dRfosfaatin). Tämä pieni bifunktionaalinen polymeraasi Pol beetta, jolla on lyaasiaktiivisuutta, poistaa abaasisen (emäksittömän) tähteen ja kiinnittää oikean yksittäisen emäksen. Leesiot, jotka leikataan, excidoidaan, tällä monofunktionaalisella DNA- glykosylaasilla korjataan short tai long patch pathway- tien avulla.
ja b) Bifunktionaaliset DNA-glykosylaasit käyttävät veden sijasta aktiivikohdan amininukleofiiliä. Eliminaatioreaktiossa lähtee tällöin myös abaasisen nukleotidin 3´-fosfaattikin irti.
Tällainen beetta-lyaasiaktiviteetti glykosylaasissa antaa olettaa, että seuraavan korjausaskeleen suorittaa polymeraasit eikä lyaasit. (Leesiot jotka leikataan irti eli excidoidaan tällä glykosylaasilla, korjataan short patch- tietä)
BER -funktiossa on korjausvaiheessa erotettavissa kahta erilaista edellä mainittua tietä: long patch pathway ja short patch pathway. Tien valinta tapahtuu DNA-vaurion laadun, glykosylaasityypin, DNA-polymeraasityypin (beetta, deltta, epsilon) ja mahdollisesti solusyklivaiheen perusteella:
In vivo (elävässä kehossa) on short patch- tie prevalentein ja siinä tapahtuu yksittäisen nukleotidin uudelleen sijoittaminen.
Long patch -BER käsittää useamman nukleotidin, 2- 8 kappaleen, korvaamista, Tämä tarkoittaa, että 3´-kohtaan lisäytyy useampia nukleotidejä, ” flap”, joka sitten otetaan endonukleaasilla irti
Entsyymin nimi on flap- endonukleaasi1 (FEN1).Tämä pitempi paikkaus voi olla aiheellinen, jos AP-kohta, abaasinen kohta, on vaurioitunut siten että Pol beetta- lyaasientsyymi ei pääse toimimaan, kun kohta ei ole sen lyaasiaktiivisuuden vaatima substraatti.
- Lisäys 15.3. 2024: LONG RANGE, SHORT RANGE
Component of the core long-range non-homologous end joining (NHEJ) complex (also named DNA-PK complex) composed of PRKDC, LIG4, XRCC4, XRCC6/Ku70, XRCC5/Ku86 and NHEJ1/XLF (PubMed:16571728, 17317666, 33854234)Addi tional component of the NHEJ complex includes PAXX (PubMed:25574025, 25941166).
Following autophosphorylation, PRKDC dissociates from DNA, leading to formation of the short-range NHEJ complex, composed of LIG4, XRCC4, XRCC6/Ku70, XRCC5/Ku86 and NHEJ1/XLF (PubMed:33854234).
Interacts with POLL (DNA polymerase lambda); promoting POLL recruitment to double-strand breaks (DSBs) and stimulation of the end-filling activity of POLL (PubMed:30250067).
Abaasinen kohta sinänsä merkitsee sytotoksista ja mutageenista kohtaa. Arvellaan, että glykosylaasi jää tähän abaasiseen kohtaan sen jälkeen, kun emäs on irti ja entsyymi APE1 ottaa sen sitten pois siitä. Näitä on kaksi ihmisellä APE1 ja APE2, AP- endonukleaaseja, runsaita proteiineja, esim solussa voi olla 350 000-7 miljoonaa molekyyliä tätä APE1-proteiinia. Sitä kertyy esim DNA-mutkiin ja se kiihdyttää polymeraasi beettaa ja edistää yksittäisen nukleotidin asianmukaista korjautumista.
Mainitaan vielä proteiini XRCC1 tässä BER-järjestelmässä. Sillä on jokin keskeinen ko-ordinoiva osuus BER- järjestelmän entsyymien aktiivisuudessa, koska asiaan kuuluu laajat interaktiot. Jos tämä XRCC1 -funktio puuttuu, solut ovat hypersensitiivisä jonisoivalle säteilylle, oxidoiville tekijöille ja alkyloivlle agensseille ja niissä on myös enemmän kromosomiaberraatioita ja deleetioita (2000). XRCC1- proteiinin rakennetta ei tunneta, mutta sen N-terminaali on interaktiossa polymeraasi beetan kanssa ja sen kaksi BRCT-domaania välittää interaktiota PARP-proteiineihin( poly(ADP-riboosi)polymeraaseihin) ja DNA-ligaasi III:een (2004).
- Huom vuoden 2008 tieto: The protein encoded by this gene is involved in the efficient repair of DNA single-strand breaks formed by exposure to ionizing radiation and alkylating agents. This protein interacts with DNA ligase III, polymerase beta and poly (ADP-ribose) polymerase to participate in the base excision repair pathway. It may play a role in DNA processing during meiogenesis and recombination in germ cells. A rare microsatellite polymorphism in this gene is associated with cancer in patients of varying radiosensitivity. [provided by RefSeq, Jul 2008] https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC1&keywords=XRCC1
Long patch- pathway BER- mekanismissa vaikuttaa olevan myös replikaatioon assosioitunutta.
“Knock out”(K.O.) poistogeenisyys sellaisille tekijöille BER – funktiossa kuten APE1, XRCC1 ja Pol beetta, ovat embryolle letaaleja. Jos Pol beetta puuttuu, koe-eläin ei elä postnataalisti. Myös PARP1 ja PARP2 puutteessa on embryonaalinen letaalius. Kyse on siis proteiineista, joita täytyy vitaalisti olla olemassa
NER tapahtuu neljällä vaiheella: (1) Vaurion tunnistus,(2) dual incision, vauriopalan poistoleikkaus (3) aukon täyttö, (4) loppusilauksena ligeeraus
- Global Genome repair (GG-NER) ja
- Transcription coupled repair (TC-NER): Tämä on nopeampi, vaatii RNA-polymeraasi II-läsnäoloa korjauksen kohteessa ja ne kohdat joita käytetään genomista useimmin, korjautuvat nopeimmin.
NER- defektit vastaavat ainakin kolmesta harvinaisesta eri geneettisestä häiriötilasta XP, CS ja TTD: Näitä NER- prosessin proteiineja alettiin havaita, kun tutkittiin niitä sairaustiloja, mitä NER funktion poisjääminen aiheuttaa. XP on xeroderma pigmentosum, autosomaali resessiivinen häiriö, jossa on alttius ihosyöpiin, lähinnä levyepiteeli-ja basaalisolukarsinoomaan sekä erääseen melanoomatyyppiin. XP voidaan jakaa moniin komplementaatioryhmiin, sen mukaan mitä kykyjä soluilla on täydentää toisiaan fuusiokokeissa. Löydettin 8 eri ryhmää XPA, XPB, XBC, XPD, XPE, XPF, XPG sekä XPV(variantti) (2001. XPV: Näillä potilailla on alttius ihosyöpään eikä heillä tapahdu UV-vaurion jälkeen ”accurate replication bypass”. XP-V geeni koodaa Bypass-DNA polymeraasia. CS on Cockayne syndrome. Nämä potilat ovat UV-herkkiä, mutta he eivät ole alltiita saamaan ihosyöpää. Heillä GG-NER toimii normaalisti, mutta TC-NER on puutteellinen. Heillä on normaalitranskriptiotekijöitä CSA ja CSB koodaavassa geenissä mutaatioita On löydetty potilaita, joilla on kombinoitu XP&CS syndrooma. Heillä on mutaatioita XPB, XPD tai XPG- peptideissä. TTD on tricothiodystrophia: Siinä on havaittu mutaatioita XPD ja XPB peptideissä. TTD potilaat ovat herkkiä UV:lle, mutta eivät alttiitta saamaan ihosyöpää. Heillä on pirstoilevat hiukset ja kynnet ja rikkipitoisten proteiinien vaje kudoksissa.Monia psykofyysisiä poikkeavuuksia ja suomuilevaa ihoa kuuluu oireisiin. Useimmilla TTD-potilailla NER- funktio on defektiivinen. Fenotyyppiero syöpäalttiudessa XP- ja CS -sekä TTD- potilailla on se, että TC-NER CS-taudissa ja TTD-taudissa NER triggeröi apoptoosin.
Muilta prosessiaskelilta GG-NER ja TC-NER jatkuvat samalla tavalla. XPA sitoutuu monenlaiseen DNA:han ja RPA sitoutuu ehjään DNA:han, kun XPC & hRAD23 ovat sitoutuneet. Kun vaurio on paikallistettu, osallistuvat NER-faktorit spesifisesti askeleittain. “The core transcription factor IIH” (TFIIH), jolla on 6 alayksikköä, on seuraavana komponenttina. Se on osa RNA polymeraasi lI:n basaalista transkriptiokompleksista, joka vaaditaan transcription initiaatioon ( aloitukseen). TFIIH:n kaksi alayksikköä, XPB ja XPG ovat DNA-helikaaseja, jotka suoristavat DNA:ta transcription ja NER-proseduurin aikana. TFIIH luo pullean muodostuman, jossa on epämääräinen liittymä dsDNA:n ja ssDNA:n välillä. Tämä muodostus on tärkeä, jotta kaksoisinkisiosta tulisi täsmällinen.
(2) dual incision, vauriokohdan poistaminen. Incision tekee endonukleaasit XPG ja heterodimeeri ERCC1-XPF. Nämä halkovat DNA 3´ ja 5´ leesioksi Fragmentin pituus riippuu emäsvaurion paikasta. Pätkä 24-30 nukleotidia irtoaa.
(3) aukon täyttö- ”Gap”, välipaikka, joka muodostuu, täytetään DNA polymeraaseilla delta ja epsilon.
(4) raon umpeen ligeeraaminen. DNA ligaasi I ligeeraa umpeen muodostuneen raon
Bakteereilla arvellaan merkkinä toimivan metyloitumisasteen (1995). Vanhempi DNA on metyloituneempi. Metylaation puute taas on signaali strand selection- tapahtumalle Kolibakteerilla MutS homodimeeri tunnistaa virheen ja sitoutuu mismatch kohtaan. MutL homodimeeri kutsutaan paikalle ja sitten MutH tunnistaa ja pilkkoo fosfodiesterirungon metyloitumattomasta kohdasta lähellä olevalta dam kohdalta joka on hemimetyloitu. Sitten erotetaan emäkset dam kohdan ja mismatch kohdan väliltä ja resyntetisoidaan.
Eukaryoottisilla EI TUNNETA strand discrimination- mekanismia (2001), mutta se saattaa olla kontaktissa lähellä olevaan replikaatiojärjestelmään.
Jos ihmisellä on vajetta MMR korjautumisissa, mutaatioitten määrä lisääntyy huomattavasti. Henkilöt ovat alttiimpia syövälle, lähinnä colon carsinoomalle, myös mahalaukun, endometriumin ja ovariumin syövälle (2003). Jos esiintyy itusolulinjan MMR-geenien mutaatioita, 80%:lle näistä henkilöistä kehitty colon karsinooma (1996) Näistä HNPCC tapauksista useimmilla on mutaatioita geeneissä MLH1 ja MSH2.
Ihmisellä on MMR- järjestelmässään tekijöitä hMutSa kompleksi ( heterodimeeri hMSH2 ja hMSH6). Tämä kompleksi voi korjata pieniä silmukoita MMR- prosessin aikana.
Heterodimeeriset proteiinit hMutL-kaltaiset proteiinit ( hMLH1, hPMS2, joka on hMutL alfa ) ,(hMLH1, hPMS1, joka on hMutL beta) ovat interaktiossa MSH kompleksien ja replikaatiotekijöitten kanssa. MSH omaa ATPaasi ominaisuutta, joka on essentielli mismatch repair- toiminnassa.
Joukko proteiineja osallistuu uuden, vaurioituneen DNA-rungon excisio- ja resynteesitapahtumin. Näitä ovat Pol d ja e; RPA, PCNA, RFC, exonukleaasi I ja endonukleaasi FENI.
MMR komponentit ovat myös interaktiossa rekombinaatioon ja NER tapahtumiin kuuluvien proteiinien kanssa.
Apoptoottisesa tiessä mukana olevat tekijät C-Myc ja MAX omaavat interaktiota MSH2- tekijään.
PMS2 omaa interaktiota p73:een päin. ( p73 ja p63 ovat mukana apoptoosin induktiossa jos syynä on DNA-vaurio vaikka p53 funktiota esiintyy).
On todisteita siitä, että MMR- proteiinit ovat myös MEIOOSISSA mukana mismatch –tilanteen korjauksissa.
Näitä ovat MutS, MSH4, MSH5,MutL, MLH1, MLH3, PMS2.
MSH2 on mukana seuraavassa: error free homologous recombination
( 2003)
MMR-proteiinit ovat mukana myös “chek point “-activaatioissa DNA vaurion jälkeen. Tarvitaan tietty MSH2-pitoisuus, jotta G2/M checkpoint voi aktivoitua.
Jonisoivan säteilyn jälkeen tarvitaan MMR-systeemiä aktivoimaan S-faasi “check point”. Jos MLH1 ja MSH2 puuttuvat, vallitsee säteilyresistentti DNA-synteesi.
Jos MMR puuttuu, “check point” kinaasi CHK2 ei fosforyloidu eikä CDC25A hajoa.
(Ps. Kirjoitin näitä muistiin tulevaisuuta varten , en siihen aikaan oikein ollut perillä genomin korjauksen yksityiskohdista ollenkaan pari kymmentä vuotta sitten, mutta asia kiinnosti lähinnä radioaktiivisuuden vaikutuksen kannalta).
Miten voi molempien vastaavien DNA-kromatidien samanaikainen vaurioituminen ylipäätänsä jotenkin korjaantua?
Kun solu havaitsee kaksoisvaurion DNA:ssa, monta kaskadia aktivoituu pysäyttämään solusyklin ja korjaustekijöitä alkaa kertyä paikalle:
ATM-kinaasi on kaskadien varhaisaloittaja. Sen puute taas aiheuttaa progressiivisen neurodegeneraation, immuunivajauden, steriliteetin, ja kohonneen syöpäriskin. ATM on hypersensitiivinen jonisoivalle säteilylle (IR), mutta sillä ei ole yliherkkyyttä UV-säteilylle. (ATM tulee sanoista, ataxia teleangiectasia mutated kinase). ATM ( dimeeri tai oligomeeri) aktivoituu fosforyloitumalla ja kromatidin muutos jo aktivoi sen (2003), ATM-funktion puutteessa -jos solu altistuu jonisoivalle säteilylle, onkin solusyklin G1/S-, S- ja G2/M- “chek point” kohtien aktivoituminen puutteellinen ja jää tapahtumatta. (radioresistant DNA synthesis phenotype). On kyllä toinen kinaasi ATR, joka osin voi toimia tässäkin, vaikka ATM puuttuu.
Kuitenkin p53 (genomin suojelijan, The Guardian of Genome) ) fosforylaatio ja stabilisaatio vaatii pääasiassa ATM , jos on jonisoiva säteily (IR) kyseessä, ja ATR tarvitaan p53- fosforylaatioon, kun on UV säteily kyseessä.
Kun jonisoiva säteily ( IR) aiheuttaa solusyklin pysähtymän, osallistuu seuraavia tekijöitä ATM-kinaasin substraatteina:
p53, Mdm2, CHK2, (G1 checkpoint) (MMR tarvitaan myös)
NBS1, BRCA1, FANCD2, SMC1 (S-faasin pysähtymä)
BRCA1, hRAD17 (G2/M checkpoint) (2003)
Toinen jättiproteiini aktivoituu, kun on kaksoisvaurio DNA:ssa. Sen nimi on DNA-PK:
Tapahtuma, joka on riippuva ATM. ATR ja DNA-PK-aktivaatiosta, on Histoni H2AX fosforylaatio megabaasietäisyydellä vauriosta sijaitsevassa domaanissa. Se kohta tarvitaan säteilyn vikuuttamien kohtien indusoimien essentiellien proteiinien kertymistilaksi, alustaksi, DSB vaurion lähistöllä- (vähän niinkuin hengenpelastus heikoilla jäillä tarvitsee myös tukevampaa, ”olevaista” alustaa avannon läheltä auttajille ( scaffolding proteins rakenteellsita tukea tai chaperones, kaitsijaproteiineja)
Lymfooma frekvenssi nousee, jos on DSB korjausmekanismin puutos ja kromosomiaberraatio (Nijmegenbreakage syndrome, NBS).
Miten DNA katkeaa molemmista kromatideista?
DSB, DNA:n molemman ketjun samanaikainen vaurio tapahtuu lähinnä
jonisoivan säteilyn (IR) aiheuttamana, vapaista radikaaleista (ROS),
kemiallista vaikutuksista ja yksinkertaisen DNA-ketjun vaurion
replikoitumisesta.
Arvellaan että yhden solusyklin aikana kehittyy noin 50 tällaista DSB- vauriota. Tämä on ekvivalenttinen siihen lukuun, mitä heikosti jonisoivan säteilyn määrän 1.5-2.0 Gy (Gray yksikköä) sanotaan aiheuttavan ( 2003).
DSB- vauriot voivat korjaantua joko “non-homologous end joining” (NHEJ)- menetelmällä tai yleisesti ottaen tarkempaa homologisen rekombinaation (HR) tietä käyttäen.
Ihmisen soluissa DSB -vaurion korjaus tapahtuu pääasiallisesti NHEJ-tietä. Kuitenkin HR ja NHEJ voivat kilpailla DSB-vaurion korjaamisesta (2003), erikoisesti myöhäisen DNA-synteesi (S) faasin ja G2- faasin rajakohdassa, kun sisarkromatidit ovat lähellä toisiaan: Tässä kohtaa on HR päämekanismina DSB-korjauksessa.
NHEJ- menetelmä (Tästä DNA-korjausmenetelmästä katson 15.3. 2024 muutaman geenitiedon sekä XRCC ryhmän geenit: X-ray Repair Cross Complementing)
Katkoskohdan päihin alkaa kertyä korjausproteiineja. NHEJ alkaa siten, että katkenneet DNA-päät kiinnittävät runsasta Ku70/Ku86 heterodimeeriä ja DNA-proteiinikinaasin (PK) katalyyttistä(c) alayksikköä(s) nimeltä DNA-PKcs. Tämä kinaasi aktivoituu, kun se kiinnittyy DNA-päihin ja fosforyloi proteiinin ARTEMIS (SCIDA). (Uutta tietoa on IP6 molekyylin essentielli osuus 2024)
https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DCLRE1C&keywords=ARTEMIS
DNA-PKcs ja ARTEMIS muodostavat kompleksin. Niin koeputkessa kuin kehossa tämä kompleksi toimii endonukleoosin tavoin ja trimmaa DNA-päät DSB-vauriokohdassa ( poistaa 5´ ja trimmaa pitkät 3´ pätkät) ja on kykenevä irrottamaan (pilkkomaan) DNA-pinnimuodostumat, joita VDJ-rekombinaatiossa tulee. Arvellaan, että polymeraasi täyttää gap-aukkoa NHEJ:n aikana, mutta ei tiedetä, mikä niistä ( template -dependent fill in synthesis). Arvellaan, että Polymeraasi u ( myy) on asialla. (2002). Kohdan sinetöi sitten XRCC4-DNA ligaasi-IV-kompleksi.Ketjut ovat korjautuneet ( error prone).
(Lisätieto 15.3. 2024 Vrt. XRCC70, XRCC80:
XRCC1, SCAR26 (19q13.31: BER, efficient repari of ssDNA breakage caused by IR, alkylating agents
XRCC5/Ku80 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC5&keywords=Ku80 ja
XRCC6/Ku70 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC6&keywords=Ku70
XRCC3/RAD51 part of PALB2 scaffolded HR complex (BRCA2 and RAD51) which has role in DNA repair HR)https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC3&keywords=XRCC3
XRCC2 , (7q36.1) part of the RAD51 paralog protein complex BCDX2, which acts in BRCA1-BRCA2-dependent HR pathway upon DNA damage. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC2&keywords=XRCC2
XRCC4 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=XRCC4&keywords=XRCC
- LISÄYS 15.3.2024: [DNA repair protein XRCC4]: DNA non-homologous end joining (NHEJ) core factor, required for double-strand break repair and V(D)J recombination (PubMed:10757784, 10854421, 17124166, 16412978, 8548796, 25742519, 12517771, 17290226, 22228831, 25597996, 25934149, 26100018, 26774286). Acts as a scaffold protein that regulates recruitment of other proteins to DNA double-strand breaks (DSBs) (PubMed:15385968, 20852255, 26774286, 27437582). Associates with NHEJ1/XLF to form alternating helical filaments that bridge DNA and act like a bandage, holding together the broken DNA until it is repaired (PubMed:26100018, 27437582, 28500754, 21775435, 22287571, 21768349). The XRCC4-NHEJ1/XLF subcomplex binds to the DNA fragments of a DSB in a highly diffusive manner and robustly bridges two independent DNA molecules, holding the broken DNA fragments in close proximity to one other (PubMed:27437582). The mobility of the bridges ensures that the ends remain accessible for further processing by other repair factors (PubMed:27437582). Plays a key role in the NHEJ ligation step of the broken DNA during DSB repair via direct interaction with DNA ligase IV (LIG4): the LIG4-XRCC4 subcomplex reseals the DNA breaks after the gap filling is completed (PubMed:9242410, 10757784, 10854421, 12517771, 17290226, 19837014). XRCC4 stabilizes LIG4, regulates its subcellular localization and enhances LIG4's joining activity (PubMed:9242410, 10757784, 10854421, 12517771, 17290226, 21982441, 22228831). Binding of the LIG4-XRCC4 subcomplex to DNA ends is dependent on the assembly of the DNA-dependent protein kinase complex DNA-PK to these DNA ends (PubMed:10757784, 10854421). Promotes displacement of PNKP from processed strand break termini (PubMed:20852255, 28453785). ( XRCC4_HUMAN,Q13426 )[Protein XRCC4, C-terminus]: Acts as an activator of the phospholipid scramblase activity of XKR4 (PubMed:33725486). This form, which is generated upon caspase-3 (CASP3) cleavage, translocates into the cytoplasm and interacts with XKR4, thereby promoting phosphatidylserine scramblase activity of XKR4 and leading to phosphatidylserine exposure on apoptotic cell surface (PubMed:33725486). ( XRCC4_HUMAN,Q13426 )
Jos tämä ARTEMIS joutuu inaktivoivan mutaation kohteeksi, seuraa kliinisesti vaikea kombinoitu immuunipuutostila (SCID) ihmisessä. Koe-eläimessä todetaan vastaavaa tilaa jos DNA-PKcs on toimimaton. Fenotyyppi johtuu funktionaalisen VDJ rekombinaatiokyvyn puutteesta.
HR (Homologous recombination)
Hiivasolussa tapahtuu DSB- kaksoisvaurion korjaaminen HR-menetelmällä päasiassa, kun on diploidi vaihe, NHEJ järjestelmä nähdään jossain hiivan haploidissa vaiheessa.
Multisellulaariset eukaryosyytit sen sijaan valitsevat kaksoivaurion korjauksessa lähinnä NHEJ-menetelmän. Syynä on sekin, että HR näissä monisoluisissa eukaryosyyteissa on liian hidas prosessi ja voisi johtaa kromosomaalisiin translokaatioihin, koska niissä on laajempia DNA- toistojen homologisia fraktioita, mistä seuraa homologista cross over-reaktiota.
Koe-eläimellä HR-faktoreitten (RAD51,RAD51B,RAD51D, Xrcc2, Mre11, NBS1) puute voi johtaa embryoletaalisuuteen, poikkeuksena tekijät ATM, RAD52, RAD54. Tästä päätellään, että on HR funktio on tärkeä.
HR tapahtuma( kuva) : RAD 50, Mre11, NBS1 kompleksi resekoi 5´-päät. RPA suojaa 3´-päät. RAD51 sitoutuu 3´-päihin.
RAD51, RAD 52 ja RAD 54 stimuloivat homologien etsintää ja haaran migratiota. Homologiset ketjut syntetisoituvat.
Ligaasi siloittaa korjautuman ja kromatidit erottautuvat. Ketjut ovat korjautuneet ( error-free).
5 RR- DNA REPAIR MECHANISM
Recombination repair
(Edellä on mainittu HR )
TOLERANCE, BYPASS
DNA-korjausmekanismien lisäksi solulla on vaurion toleranssi ja ohitusmekanismi
By-pass of damage in human cells
Vaurion ohittaminen ihmissoluissa
Polymeraasit pitävät yllä genomin integraatiota replikaation ja korjaamisten kuluessa. (alfa, beta, gamma, delta, epsilon polymeraasit).
On löydetty 10 uutta polymeraasia viimeksi kuluneiden 4 vuoden aikana. Telomeraasit ja terminaaliset transferaasit ovat joukossa. Polymeraaseja on nyt 19 ainakin. Ne jaetaan 4 eri perheeseen A, B, X ja Y-perheet.
Kun replikaatiokoneiston template- ketjussa on tullut vaurio-ja blokkitilanne, replikaatiohaarukan progressio pysähtyy. Eri mekanismit koettavat ratkaista ongelmaa: rekombinaatio, vaurion ohitus haarukan regressiolla tai haarukan restauraatiolla, ohitus translesionaalilla synteesillä (TLS).
On olemassa viisi hiljattain havaittua transleesio-replikaatioentsyymiä ( neljä pol ja REV1). Kolme viimemainittua on superperheY-jäseniä.
Mitä funktioita eri polymeraaseille oletetaan? Mm seuraavaa tiedetään: :
Pol alfa ( replication priming; Pol beta ( osallistuu BER- tapahtumaan);
Pol gamma ( osallistuu BER- tapahtumaan); Pol delta( johtavan ketjun replikaatiossa, korjauksessa); Pol epsilon ( vastapäisen ketjun replikaatiossa, korjauksessa, virheen sensorina); Pol zeta ( TLS tapahtumassa , Ig hypermutaatiossa); Pol eta ( TLS-tapahtumassa, sivuosaa Ig hypermutaatiossa) ; Pol theta ( cross link -korjauksessa);
Pol iota ( TLS ja BER-tapahtumissa, myös tärkeä Ig hypermutaatiossa); Pol kappa (TLS-tapahtumassa); Pol lambda ( meioosissa, BER-tapahtumassa) , Pol myy( dsDNA vaurion korjauksessa); Pol sigma ( sisarkromatidikoheesiossa); Pol phi ( rRNA);
REV1 ( TLS-tapahtumassa); TdT ( Ig ja T-soluresptorien geenin diversiteetissä).
Transcription regulation
Repair of alkylation damage
RNA:n korjaantuminen
Proteiinin korjaantumismekanismeja
ERIKSEEN URASIILISTA
URACIL DNA GLYCOSYLASE ENCODED BY THE UNG GENE
URACIL IN DNA
Miten urasiilia voi joutua DNA:han?
dUMP voi inkorporoitua DNA synteesin aikana dTMP:n sijasta. dUTP on hyvä substraatti monille bakteerien ja imettäväisten DNApolymeraaseille.dUTP muuttuu nopeasti dUMP muotoon d-UTPaaseilla. UTP kuuluu lähinnä sokeriaineenvaihdunnan puolelle, missä opiskelija siihen ensinnä tutustuu.
Suurin osa urasiilista katsotaan tulevan DNAsynteesistä käsin. Koska U pariutuu A:n kanssa ei uskota sen olevan kovin mutageeninen, mutta DNA.ssa esintyvä U näyttää olevan taipuvainen vaikuttamaan promoottorin säätelijäelementteihin sitoutuviin proteiineihin.
Cytosiinideaminaatio tuottaa urasiilia. Se voi olla spontaania urasiilin muodostusta.
Tämä taas tekee G:C parin tilalle A:T transition kun replikoituminen on tehty valmiiksi, jos korjaantumista ei tapahdu.
Ongelma on urasiilin kertymä huononevassa genomissa
ja urasiilin korjaantumiseen väitöskirja käyttää suuren tilan.
Tavallisin mutaatio on yllämainittu Cà T muutos.
. Arvellaan, että joka päivä 100-500 urasiilia muodostuu deaminoiduista cytosiineistä ihmissoluissa.Cytosiini deaminoituu 100 kertaa nopeammin ssDNA:ssa kuin dsDNA.ssa. DNA:n kaksoisketju on suojaava muodostuma.
Cytosiini syklobutaanipyrimidiinidimeerinä deaminotuu vielä nopeammin ja lie syy mutageneesiin UV-sädetyksen jälkeen..
DNA.ssa 3 % kaikista sytosiineista metyloituu 5-asemaan, jolloin siitä 5-meC ja se deaminoituu 3-5 kertaa nopeammin ja taas tulee deaminaatiossa thymiiniä ja täten T:G mismatch on mahdollinen, ellei se korjaannu ennen replikaatiota.
5-meC-metyylitransferaasi edistää urasiiliksi deaminaatiota, jos SAM pitoisuus on matala.
On ainakin kaksi DNA cytosiinideaminaasi entsyymiäkin genomissa.
AID= activation induced cytosine deaminase ja APOBEC-3G. Nämä ovat mukana hankitussa ja innate immuunipuutteessa. AID löydettiin B-soluista ja vaikuttaa lähinnä RNA:n cytosiiniin, mutta voi vaikuttaa yksinkertaiseen DNA-ketjun cytosiiniinkin in vitro.
Geenituotteen yliexpressio triggeröi mutaatioita, mikä tas käsittää sytosiinin C deaminaation urasiiliksi U.
APOBEC-3G löydettiin aluksi geeninä, joka ei salli HIV-propagaatiota
Kun virionin infektiviteettifaktori Vif oli defektiivinen.
APOBEC-3G deaminoi sytosiinin urasiiliksi. Ja saattaa C:n muuttumaan T:ksi. ( C_T transitio).
Vif puutteeessa antriretroviraalinen mekanismi oli cytosiinin deaminaatio urasiiliksi miinus strandissa ja G A mutaatio plus strandissa HIV-1 DNA:ssa.
APOBEC-3G antiretroviraalina deaminoi ss DNA ( s 24 enemmänkin tätä mekanismista).lopulta tapahtuu virus clerance, viruksen mutationaali inaktivaatio ja endonukleolyyttinen hajoaminen tai toinen cDNA srand replikaatio blokeerautuu.Ihmisgenomi kooda ainakin kymmentä APOBEC perheen jäsentä.(Wedekind 2003).
Yksityiskohtia DNA:n emästen korjausjärjestelmistä
on runsaasti tässä kirjassa.
Mikä käytännön merkitys tällä DNA:n korjaantumiskyvyllä olisi ihmiselle?
Esim. Alzheimerin taudissa on havaittu kohonnut oxidatiivinen vaurio DNA, RNA ja proteiinimateriassa. Samalla kun muodostuu amyloidiplakkeja. 8-hydroxyguanosiini muotoa kehittyy tavallista enemmän (8-oxoG) Näin RNA tuottaa jotain epänormaalia ellei 8-oxoG korjaannu.
Lisäksi proteiini jota tuottuu vaatii myös antioksidatiivisen suojautumisen oksidatiivisilta vaurioilta. Varsinkin metioniini, cysteiini, tyrosiini ja tryptofaani vaurioituvat helposti reaktiivisista happimolekyyleistä.
Aminohappomutaatiot tekevät epästabiileja proteiineja ja aggregaatteja
Kun lukee DNA:n vaurioista saattaa ihmiskunnan suhteen tulla pessimistisiä prognostisia ajatuksia, mutta aivan pinvastainen vire on Becker-Kleinsmith-Hardin oppikirjassa ”The World of the cell”: 5.painoksen sivulla 541. DNA Damage and Repair- otsikon alla “The net rate at which organisms accumulate mutations is quite low; by some estimates, an average gene retains only one mutation every 200 000 years. The underlying rate of DNA mutation, however is far greater than this number suggests, because most damage is repaired shortly after it occurs and therefore does not affect future generations. Moreover, most mutations occur in cells other than sperm and eggs, and hence are never passed on to offspring.”
2004-11-30 14:32
den 17 december 2004
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar