Taustaa(3). Kemian Nobelin palkinnon saaja professori Paul Modrich. MMR Mismatch Repair mekanismin

 Professori Paul Modrich on amerikkalainen, syntynyt 1946. Fil tri 1973 Stanfordin Yliopistosta Kaliforniasta  Hughesin Lääketieteellisen Instituutin tutkija, Biokemian professori Duken Yliopiston Lääketieteen Instituutissa,   NC, USA. 
 https://www.hhmi.org/research/dna-mismatch-repair-and-genetic-stability

• Paul Modrich osoitti solun jakautumisen aikana tapahtuvan DNA:n korjausmekanismin, väärin pariutuneitten nukleotidien korjaamisen. mismatch repair (MMR) . Mismatch korjausjärjestelmän olemassaolo vähentää DNA:n kopioimisessa tapahtuvia virheitä noin tuhatkertaisesti. Mismatch-virheitä aiheutuu m.m. eräässä perinnöllisessä   suolistosyövässä.  Vuoden 2015 Nobel-palkinnonsaajat antavat perustavaa tietämystä  solun toiminnoista ja sellaista tietoa, jota voi hyödyntää uusien syöpähoitojen kehittämiseen.

Paul Modrich har visat hur cellen korrigerar felaktigheter som uppstår när DNA kopieras under celldelningen. Mekanismen, mismatch repair, minskar DNA-kopieringens felfrekvens ungefär tusen gånger. Medfödda fel i mismatch repair orsakar bland annat en ärftlig form av tarmcancer.

2015 års Nobelpristagare i kemi har gett oss grundläggande insikter i hur celler fungerar, kunskaper som till exempel går att använda för att utveckla nya cancerbehandlingar. 
 

http://www.kva.se/globalassets/priser/nobel/2015/kemi/sciback_ke_en_15.pdf

MMR  

• DNA:n replikoituminen ei ole virheetön tapahtuma. Aina on mahdollisia, että synteesin aikana tulee jokin virheellinen nukleotidi uuteen DNA-säikeeseen oikean parin sijasta. (Oikeita pareja DNA-säikeessä muodostavat Watson Crick emäsparit A-T ja G-C ). Tuloksena väärästä parista muodostuukin Ei-Watson-Crick- emäspari ja silloin kauniiseen DNA-kaksoissäikeen helixrakenteeseen tulee jokin poikkeava hahmo. Tämän tyypin virheitä sanotaan mismatch- virheiksi ,yhteensopimattomuuksiksi, ja sellaiset voivat aiheuttaa DNA-sekvenssissä muutoksen, esim. siitä johtuu mutaatioita.
• Ensisijaispuolustuksena tällaista yhteensopimattomuutta vastaan replikoituvat DNA-polymeraasit sisältävät jo itsessään 3´-5´´- exonukleaasiaktiivisuutta, jonka avulla ne voivat saman tien oikoluke( korrektuurilukea) proofread- vastasyntetisoitua DNA-säiettä. Tämä heti oikova  aktiviteetti voi korjata virheen DNA-replikaation aikana kääntämällä polymeraasin suuntaa ja leikkaamalla virheellisesti johdetut nukleotidit pois. Vaikka oikoluku  tehokkaasti korjaakin useimmat virheet joita DNA-synteesin aikana tapahtuu, joitain ei-Watson-Crick-emäspareja kuitenkin jää jäljelle. 

As noted above, the DNA replication machinery is not error-free. There is always the possibility

that an incorrect nucleotide is introduced during synthesis of a new DNA strand. As a result, a

non-Watson-Crick base pair is formed, which distorts the double-stranded DNA helix. These

types of errors are known as mismatches and they have the capacity to change the sequence

of DNA, i.e. to introduce mutations.

As a first line of defence against mismatches, replicating DNA polymerases contain a 3′to 5′exonuclease activity that allows them to pro-of-read the newly synthesized DNA strand [49]. The exonuclease activity can correct mistakes during DNA replication by reversing the direction of the polymerase and excising incorrectly introduced nucleotides. Even if proofreading efficiently corrects most mistakes made during DNA synthesis, some non-Watson-Crick base pairs still remain.

Miten DNA toimii jos on tullut pysyvä virhe 

• On laskettu, että replikoivat DNA-polymeraasit, joilla on purkaus- ja heti- korjaus-kykyä omaavat in vitro virhetiheyden 5 x 10E(-5). MMR alentaa virhetiheyttä merkitsevästi ja mutaatiotiheyttä esim ihmisen itusoluissa arviolta määrään 1x 10(-8) emäsparia kohden solusukupolvessa
•  Varhaisimmat MMR tutkimukset teki geneetikot, joita kiinnosti rekombinaatio. Robin Holliday teki oletuksen, että eri DNA-juosteitten keskiset heteroduplexit muodostuisivat rekombinaation aikana. Niitä mismatcheja, joita tällä tavalla muodostui, täytyi jonkin laadun solusysteemin korjata johtaen geenin konvertoituminen. Todellakin, jos transfektoitiin lambda fagin DNA:n heteroduplex molekyylejä E. Coli bakteeriin, seurasi mitsmatchien korjaantumisia, mutta siihen vaikutukseen tarvittavaa entsyymisysteemiä ei tunnettu. 
• Vuonna 1976 tuli uusi edistysaskel, kun Robert Wagner ja Matthew Meselson raportoivat , että saman DNA heteroduplexin kahden tai useamman lähellä sijaitsevan kohdan korjaantuminen tapahtui useammin samassa säikeessä kuin vastapäisessä säikeessä.

To correct these errors, cells use mismatch repair. It is estimated that that replicative DNA polymerases with proofreading in vitro have error frequencies of about 5 ×10-5.

Mismatch repair lowers this frequency significantly and the mutation rate in for example human germ cells is estimated to be close to 1 ×10-8 per base pair per generation [50].

The early studies of mismatch repair were mainly carried out by geneticists interested in recombination. Robin Holliday had hypothesised that heteroduplexes between different DNA strands would be formed during recombination [51]. The mismatches formed in this way had to be corrected by some sort of cellular system, leading to gene conversion. Indeed, transfection of

heteroduplex molecules of lambda phage DNA into E. coli led to repair of the mismatches, but the enzymatic system required for this effect was unknown.

An important step was taken in 1976, when Robert Wagner and Matthew Meselson reported that repair of two or more close sites on the same heteroduplex DNA molecule occur more often on the same strand than on the opposite strand [52].

• Tästä havainnosta tehtiin oletus, että mismatch-korjaantumismekanismi kohdistuu yhteen juosteeseen juostespesifisesti, jolloin salliutuu pitkien DNA jaksojen korjaantuminen. He myös punnitsivat sitä mahdollisuutta, että juostespesifistä MMR mekanismia voi käyttyä korjaamaan ei-kanonisia emäspareja, joita DNA-synteesin aikana muodostuu. Korjauskoneisto voisi ohjautua vastareplikoituneelle säikeelle joko jossain erityisessä suhteessa replikaatiokoneistoon tai sitä ohjaisi vastasyntetisoituneen säikeen alimetyloitunut tila. E. Colissa DNA on normaalisti metyloitunutta molemmista säikeistään GATC-kohdilta, mutta juuri kun DNA on syntetisoitumassa niin vastasyntynyt säie on alimetyloitunutta sellaisen ajanjakson, mikä voisi sallia MMR- koneiston erottaa vastasyntetisoituneen ja templaattina toimivan DNA-säikeen toisistaan. Tätä havaintoa tuki sellainen vuonna 1975 tehty huomio, että solun DNA-metylaasin ( entsyymin, joka lisää metyyliryhmän GATC- jakson adeniiniin) puuttuessa E-Colin mutaatiotiheys oli suurempi .
• Mismatch -korjausmekanismin genetiikka selkiytyi yhä paremmin, kun Barry W. Glickman ja Miroslav Radman osoittivat metylaatio-ohjattuun DNA MMR -korjausmekanismiin tarvittavat geenit (mutH, mutL, mutS, uvrD)

This observation led them to propose that mismatches are repaired by a strand-specific mechanism directed towards one strand, which allows for repair of long DNA tracts. They also speculated that strand-specific mismatch repair could be used to correct non-canonical base pairs formed during DNA synthesis. The repair machinery could be guided to the newly replicated strand either via a special relation to the replication machinery or directed by under-methylation of n the newly synthesised strand. In E. Coli DNA is normally methylated on both strands at GATC-sites, but during DNA synthesis the nascent strand is unmethylated for a period of time [53], which could allow the mismatch repair machinery to distinguish newly replicated DNA from the template DNA strand. In support of this notion, loss of cellular DNA methylase, the enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence GATC, was already in 1975 shown to cause higher mutation rate in E. coli [54]. The genetics of mismatch repair was further clarified when Barry W. Glickman and Miroslav Radman could demonstrate (Sivu 10) that mutH, mutL, mutS and uvrD genes were all required for the methylation-instructed DNA mismatch correction [55].

• Suoraa näyttöä metyylien ohjaamasta MMR korjausmekanimsista saatiin vuonna 1983. Ensin Paul Modrich ja Matthew Meselson käyttivät heteroduplex- konstruktiota ja DNA-metylaation määriteltyjä tiloja osoittaakseen, että todellakin DNA-metylaatio ohjasi juostespesifisesti väärinpariutuneen emäksen eliminaatiota kolibakteerissa. Modrich kehitteli edelleen menetelmän, joka salli DNA MMR korjausmekanismin analyysin soluttomassa E.Coli -uutteessa. Menetelmässään Modrich käytti bakteerifagi-heteroduplexeja, mutta johti mismatchit toisiaan peittävillä sekvensseillä, joita tunnisti kaksi erilaista katkaisija- endonukleaasia ( restriktio-entsyymiä) . Noin 1000 emäsparia (bp) tästä mismatch -kohdasta oli GATC- metylaatiokohtaa, jota saattoi kontrolloidusti metyloida ja täten käyttää monitoroitaessa juostespeisfistä korjausta. Tätä menetelmää käyttamällä Modrich pystyi osoittamaan, että korjausaktiivisuus riippui ATP-energiasta ja heteroduplexin metylaatiotilasta. Hän osoitti samalla, että kaikki mutaatiot, jotka olivat kohdanneet geenejä mutH, mutL, mutS ja uvrD- heikensivät MMR- järjestelmää soluvapaassa E- Coli- uutteessa. Tällä elegantilla menetelmällään Modrich saattoi tutkimustyösarjassaan eristää erilaisten korjausgeenien tuotteita miltei homogeenisyyteen saakka, identifioida proteiineja ja tutkia niiden ominaisuuksia in vitro hyvin yksityiskohtaisesti.

Direct evidence for methyl-directed repair of mismatches came in 1983. First, Paul Modrich and Matthew Meselson used heteroduplex constructs with defined states of DNA methylation to demonstrate that DNA methylation indeed directed strand-specific elimination of mismatches in E. coli [56]. Furthermore, Modrich developed an assay that allowed analysis of DNA mismatch repair in cell-free E. Coli extracts [57].

In his assay, he used the classical bacteriophage heteroduplexes, but introduced mismatches within overlapping sequences recognised by two different restriction endonucleases. About 1,000 bp from the mismatch was a GATC methylation site, which could be methylated in a controlled way and thus used to monitor strand-specific correction. Using the assay, Modrich could demonstrate that the repair activity was dependent on ATP, the methylation state of the heteroduplex, and that mutations affecting mutH, mutL, mutS, and uvrD all impaired mismatch repair in cell-free E. coli extracts. With the help of this elegant assay, Modrich could in a series of papers isolate the products of the different repair genes to near homogeneity, identify the proteins and investigate their properties in vitro in great detail [58-60]. 
 

• Modrichin työ huipentui vuoden 1989 perustavaa laatua julkaisuun: hän saattoi lopulta saada aikaan toistettavasti DNA mismatch- korjaantumisen määritetyssä in vitro systeemissä. Tässä julkaistussa työssään Modrich osoitti mismatch -korjausjärjestelmän vaativan DNA polymeraasia III-entsyymin, exonukleaasi I - entsyymin ja DNA- ligaasin. Sitten hän kombinoi nämä tekijät puhdistettuihin MutH, MutL, MutS ja UvrD proteiineihin ja yksijuosteista DNA:ta sitovaan proteiiniin. Nämä tekijät yhdessä pystyivät prosessoimaan väärin pariutuneita emäksiä (mismatch-kohtia) juostespesifisellä tavalla in vivo. Proserssia ohjasi yksittäinen GATC- sekvenssi, jossa oli yksi metylaatiokohta vain yhdessä juosteessa (hemimetyloitunut juoste) ja sijaiten kaukana virheellisestä emäksestä ( mismatch-kohdasta).

Modrich’s work culminated in a ground breaking paper published in 1989 [61], in which he could finally reconstitute DNA mismatch correction in a defined in vitro system. In the paper, Modrich demonstrated the requirement of DNA polymerase III, exonuclease I, and DNA ligase for mismatch repair. He then combined these factors with purified MutH, MutL, MutS, UvrD, and single-stranded DNA-binding protein. Together these factors could process mismatches in vivo in a strand-specific manner directed by the single, GATC sequence methylated on only one strand (hemimethylated) and located distant from the mismatch.

• Tässä ja muissa tutkimuksissaan Modrich osoitti, että MutS omaa ydintehtävän MMR- korjausjärjestelmässä, nimittäin MutS tunnistaa ja sitoo ei-Watson-Crick- emäspareja. Juostespesifisyyttä varmistaa se, että MutH sitoutuu hemimetyloituun GATC- kohtaan vastasyntetisoidussa DNA-juosteessa. MutL toimii välittäjänä, joka tekee vuorovaikutuksen MutH ja MutS proteiinien kesken. MutL johtaa signaaleja MutS: ltä, ja tästä seuraa latentin MutH-endonukleaasin toiminnan aktivaatio, mistä taas tulee rako (nick) vastasyntyneeseen DNA-juosteeseen aivan hemimetyloituneen GATC-kohdan lähelle. Nyt tämä koneisto tekee helikaasin (UvrD) kanssa interaktion. Ja se yhdessä MutS, MutL ja MutH proteiinien ksnssa erottavat kaksi DNA-juostetta toisistaan kohti virheellisen emäsparin ( mismatch) sijaintia. Mutantin säikeen poisiirtäminen paikaltaan jatkuu ja pysähtyy aivan mismatchin alavirran puolelle. Vastasyntetisoitunut (poistettu säie) korvataan aukkoa täyttävällä reaktiolla, johon osallistuu DNA pol III, joka käyttää templaattina parentaalista juostetta.https://www.youtube.com/watch?v=dgPh1qigv7s

In this and other studies, Modrich demonstrated that MutS, which recognises and binds to non-Watson-Crick base pairs, performs a core function in mismatch repair system. To confer strand-specificity, MutH binds at hemimethylated GATC sites on the nascent strand. MutL acts as a mediator, which interacts with both MutH and MutS. MutL transduces signals from MutS, which leads to activation of the latent MutH endonuclease activity causing a nick in the nascent DNA strand near the hemimethylated GATC-site. The machinery now interacts with a helicase (UvrD), which together with the MutS, MutL, and MutH proteins separates the two DNA strands towards the location of the mismatch. Displacement of the mutant strand continues past, and halts just downstream of, the mismatch. The nascent strand is then replaced by a gap-filling reaction, in which DNA polymerase III uses the parental strand as a template.

Entä MMR korjausmekanismi nisäkäskehossa?

• Myöhemmin Modrich et al. onnistuivat osoittamaan MMR- korjausjärjestelmän olevan konservoitunut myös eukaryoottisessa solussa. Vuonna 2004 Moldrich pystyi saamaan aikaan ihmisen MMR- korjausjärjestelmän pelkillä puhdistetuilla tekijöillä. Päinvastoin kuin E. Colissa DNA:n metylaatio ei ole suoraan johtamassa juostespesifistä DNA- korjausta eukaryoottisella solulla. Yksi mahdollisuus on, että juostespesifiset raot (nicks), joita muodastuu DNA-replikaatiossa, voisivat suoraan ohjata juostespesifisen virheen oikaisun. Tätä tukee huomio, että MMR on tehokkaampi replikaatiohaarukan viiveellä valmistuvassa  ( lagging, bottom) säikeessä ja pelkkä vako riittää suoraan säiespesifiseen korjaukseen in vitro.  ( Oma arvelu: lagging juoste  DNA tarvitsee enemmän MMR valvontaa struktuurisyistä)
• Eräs vaihtoehto on, että MMR saattaa olla DNA:ssa heti replikaation jälkeen väliaikaisesti esiintyvien ribonukleotidien ohjaama. ( Esim. Primeerit eli alokkeet ovat RNA-materiaalia replikaatiokuplassa).( Lagging säie on ”jäljessä tuleva juoste” ja se replikoidaan fragmentteina, Okasakin fragmentit, joilla on tietty välinsä ja ligaasit sitten sinetöivät osat yhtenäiseksi)  ( Oma arvelu: tässä on enemmän RNA alukkeita läsnä)
• Muista näkokohdsita katsoen eukaryoottinen MMR on lähisukua E-Coli-systeemille ja konservoituja hmologeja ovat sellaiset tekijät kuin MutS ja MutL. Nisäkkäitten MMR järjestelmän tärkeyttä painottaa se, että tässä tiessä ilmenevät puutteet aiheuttavat perinnöllistä ei polyposis-tyyppistä - colon syöpää.

Mismatch repair in mammalian cells.

https://www.youtube.com/watch?v=HYS6EKnQcv0

Later studies by Modrich and others have demonstrated the conservation of mismatch repair in eukaryotic cells and in 2004, Modrich managed to reconstitute human mismatch repair with only purified factors [62]. In contrast to the situation in E. coli, DNA methylation does not direct (11 sivu) strand specific DNA repair in eukaryotic cells. One possibility is that the strand specific nicks formed during DNA replication can direct strand-specific error correction. In support of this notion, mismatch repair is more efficient on the lagging strand at the replication fork [63], and a single nick is sufficient to direct strand specific repair in in vitro [62, 64]. Alternatively, the mismatch repair machinery may be directed by ribonucleotides transiently present in DNA after replication [65].

In other aspects, eukaryotic mismatch repair is closely related to the E. coli system with conserved homologues to key factors such as MutS and MutL. The importance of the mammalian mismatch repair system is under scored by the finding that defects in this pathway cause hereditary nonpolyposis colon cancer [66, 67]