DNA ja RNA omaa konservoidun fosfaatti -TUKIRUNGON . Replikaation sivutuote on PPi, epäorgaaninen pyrofosfaatti.

http://www.nature.com/scitable/definition/phosphate-backbone-273

DNA synteesi vaatii paljon energiaa (dNTP) ja kun nukleotidi on liitetty runkoon, jokaisesta liitännästä jää yksi PPi, pyrofosfaatti, joten repliakaatio tuottaa runsaasti pyrofosfaatia. Ja päinvastoin: Neuroni, joka ei jakaudu , ei niin tuota pyrofosfaattia normaalisti ellei siinä ole jokin  virus jakaantumassa.

https://en.wikipedia.org/wiki/Pyrophosphate
Mikä on replikaation yhteydessä syntyvän pyrofostaatin (PPI) jatkotie?
 Tästä sivutuotteesta löytyy tekstiä:

PPi määrä inhiboi nukleiinihapposynteesiä  pyrofosforolyysi-tietä , joka reversoi polymeraasireaktiota ja rajoittaa DNA/RNA-synteesiä. Inorgaanisen pyrofosfaattin (PPi)  tuottuminen on osa DNA/RNA synteesin kehossa tapahtuvasta tiestä, jossa polymerisaatio on essentiellisti palautumatonta laatua pyrofosfaatin (PPi)  irrottua.  Inorgaanista pyrofosfaattia (PPi)  hajoittava entsyymi PPaasi katalysoi PPi:n hydrolyysin, jolloin muodostuu kaksi ortofosfaattia. Inorgaanisen pyrofosfataasin tehtävänä lienee pyrofosfaatin poissaaminen  paikalta ja niitten mekanististen  tulosten kohentaminen, jotka ovat erittäin herkkiä pyrofosfaatin akkumuloitumiselle  kuten SBE, yksittäisen emäksen poistaminen ja Sangerin sekventoiminen, ottaen erityisesti huomioon selektiivinen juosteen heikkous.  Inorgaanisen pyrofosfaatin hajoittajaentsyymi voi suuresti lisätä in vitro transkriptioreaktion  tuotteita.

P₂O₇^-4 H₂O → 2HPO₄^-2

 http://www.affymetrix.com/catalog/131330/USB/Pyrophosphatase+Inorganic+Recombinant#1_1

 SITAATTI:

Source:
Purified from E. coli cells expressing the cloned ppa gene⁽¹⁾ from Saccharomyces cerevisiae (Baker’s Yeast).

Description:DNA and RNA polymerase reactions, as well as other enzymatic reactions, generate inorganic pyrophosphate as a by-product. This by-product inhibits nucleic acid synthesis through a process called pyrophosphorolysis which reverses the polymerization reaction and limits DNA/RNA synthesis. Inorganic pyrophosphatase is part of the DNA/RNA synthesis pathway in vivo, rendering polymerization essentially irreversible by removing pyrophosphate⁽²⁾. Inorganic pyrophosphatase (PPase) catalyzes the hydrolysis of inorganic pyrophosphate to form two molecules of orthophosphate⁽³⁾:
P₂O₇^-4 H₂O → 2HPO₄^-2
Inorganic pyrophosphatase may be used to remove pyrophosphate and improve the results of techniques that are particularly sensitive to its accumulation such as single-base extension (SBE)⁽⁴⁾ and Sanger sequencing, especially with regard to selective band weakening^(5,6). Also, inorganic pyrophosphatase can greatly increase the yield of in vitro transcription reactions⁽⁷⁾.

TAUSTAA (4) Englantilainen ja ruotsalainen teksti Kemian Nobelin taustasta( koko teksti)

http://www.kva.se/globalassets/priser/nobel/2015/kemi/sciback_ke_en_15.pdf

Ruotsinkielinen kirjoitus  http://www.kva.se/globalassets/priser/nobel/2015/kemi/pop_ke_sv_15.pdf

Kaffein on puriinirakenne kuten A ja G DNA.ssa

Wikipedia: 
Caffeine is a central nervous system (CNS) stimulant of the methylxanthine class of psychoactive drugs.^[9]
  It is the world's most widely consumed psychoactive drug, but unlike many other psychoactive substances, it is legal and unregulated in nearly all parts of the world.
It is a bitter, white crystalline purine, a methylxanthine alkaloid, and thus closely related chemically to the adenine and guanine contained in deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA).
 It is found in the seeds, nuts, or leaves of a number of plants native to South America and East Asia.
The most well known source of caffeine is the seed (commonly incorrectly referred to as the "bean") of Coffea plants. Beverages containing caffeine are ingested to relieve or prevent drowsiness and to increase one's energy level.
 Caffeine is extracted from the plant part containing it for making beverages by steeping it in water, a process

Name	R1	R2	R3	R8	IUPAC nomenclature	Found In
Xanthine	H	H	H	H	3,7-dihydro-purine-2,6-dione	Plants, animals
Caffeine	CH3	CH3	CH3	H	1,3,7-trimethyl-1H-purine-2,6(3H,7H)-dione	Coffee, Guarana, Yerba mate, Tea, Kola, Guayusa, Holly
Theobromine	H	CH3	CH3	H	3,7-dihydro-3,7-dimethyl-1H-purine-2,6-dione	Cacao (chocolate), Yerba mate, Kola, Guayusa, Holly
Theophylline	CH3	CH3	H	H	1,3-dimethyl-7H-purine-2,6-dione	Tea, Cacao (chocolate), Yerba mate, Kola
Paraxanthine	CH3	H	CH3	H	1,7-dimethyl-7H-purine-2,6-dione	Animals that have consumed caffeine
8-Chlorotheophylline	CH3	CH3	H	Cl		Dimenhydrinate

See also

called infusion. These beverages are very popular; in North America, 90% of adults consume caffeine daily.

Kaffeiini ja DNA:n korjaantuminen, Fokuksessa HR, DNA:n katkeaman korjausjärjestelmä

Koska kahvin molekyyli on lähellä  DNA-puriiniemästen molekyylin hahmoa, voisikohan kahvi tehdä interaktion DNA:n aineenvaihduntaan? 

Yksi vastaus: 

LÄHDE:  Nucleic Acids Res. 2015 Aug 18;43(14):6889-901. doi: 10.1093/nar/gkv520. Epub 2015 May 27. Caffeine impairs resection during DNA break repair by reducing the levels of nucleases Sae2 and Dna2.

Tsabar M¹, Eapen VV¹, Mason JM², Memisoglu G¹, Waterman DP¹, Long MJ¹, Bishop DK², Haber JE³.

TIIVISTELMÄN SUOMENNOSTA, Abstract

Kun eukaryoottiseen soluun tulee kromosomaalinen virhe DSB, kaksoissäikeen täydellinen katkeam , aktivoituu DNA-vaurioita tarkistava kontrollikohta  ja siihen kuuluu PI3K:n kaltaisia kinaaseja ATR ja ATM ( vastaavat ovat Mec1 ja Tel1 hiivassa). DSB:n muodostumisen jälkeen Mec1 ja Tel1 fosforyloivat histonin H2A seriini-129- kohdan (gamma-H2AX). Tutkijat käyttivät tässä kaffeiinia estämään tarkistuskohdan (checkpoint) kinaaseja   DNA.n kaksoisvaurion indusoimisen jälkeen. Tutkijat osoittivat pitkittynyttä fosforylaatiota H2A-seriini-219- kohtaan  ei vaadita Mec1 ja Tel1 aktiviteeteille. Odottamatta he havaitsivat kaffeiinikäsittelyn haittaavan  HR- nimistä  kaksoissäikeen  katkeaman korjausjärjestelmää ( HR, homologous recombination)  estämällä 5´ ja 3´ päitten trimmauksen ( resektion)  ja tämä oli riippumaton Mec1 ja Tel1 inhibitiosta.

 Kaffeiinikäsittely johtaa nopeaan Sae2- ja Dna2 - tekijöitten  proteosomaaliseen silppuroitumiseen (hajoittamiseen). Sae1 on nukleaasi, jolla on tehtävää katkoskohdan päitten trimmauksessa, päitten resektion  alussa ja Dna2 on nukleaasi, joka kiihdyttää toista  laajan resektion tietä. Kun ei ole  DNA-vauriota,  Sae2 on normaalisti  epävakaa ( instabiili). 

Kommentti: Ihmisellä on DNA2 homologi:  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1763 

Ihmisellä on Sae2 homologi. RBBP8, retinoblastomaproteiinia  sitova proteiini 8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5932

Samankaltainen Sae2-kato havaitaan, jos proteiinisynteesiä estetään sykloheximidillä. Kaffeiinikäsittelyllä on samanlainen vaikutus säteilytettyihin HeLa soluihin (syöpäsoluihin)  ja se blokeeraa RPA ja Rad51 fokusten muodostumisen, jotka ovat riippuvaisia  katkenneitten kromosomipäitten  trimmauksesta: 5´ ja 3´-resektioista.  Nämä havainnot  tukevat  oivallusta kaffeiiniin  syöpäsoluja  DSB:lle herkistävsta vaikutuksesta. 

In response to chromosomal double-strand breaks (DSBs), eukaryotic cells activate the DNA damage checkpoint, which is orchestrated by the PI3 kinase-like protein kinases ATR and ATM (Mec1 and Tel1 in budding yeast). Following DSB formation, Mec1 and Tel1 phosphorylate histone H2A on serine 129 (known as γ-H2AX). We used caffeine to inhibit the checkpoint kinases after DSB induction. We show that prolonged phosphorylation of H2A-S129 does not require continuous Mec1 and Tel1 activity. Unexpectedly, caffeine treatment impaired homologous recombination by inhibiting 5' to 3' end resection, independent of Mec1 and Tel1 inhibition

. Caffeine treatment led to the rapid loss, by proteasomal degradation, of both Sae2, a nuclease that plays a role in early steps of resection, and Dna2, a nuclease that facilitates one of two extensive resection pathways. Sae2's instability is evident in the absence of DNA damage. A similar loss is seen when protein synthesis is inhibited by cycloheximide. Caffeine treatment had similar effects on irradiated HeLa cells, blocking the formation of RPA and Rad51 foci that depend on 5' to 3' resection of broken chromosome ends. Our findings provide insight toward the use of caffeine as a DNA damage-sensitizing agent in cancer cells.
© The Author(s) 2015. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

PMID:

26019182

[PubMed - in process]

PMCID:

PMC4538808

Free PMC Article
Muistiin HR homologous Recombination tapahtumasta Per Aasin artikkelsita:

• HR (Homologous recombination)

Hiivasolussa tapahtuu DSB- kaksoisvaurion korjaaminen HR-menetelmällä pääasiassa, kun on diploidi vaihe, NHEJ järjestelmä nähdään jossain hiivan haploidissa vaiheessa.

Multisellulaariset eukaryosyytit sen sijaan valitsevat kaksoisvaurion korjauksessa lähinnä NHEJ-menetelmän. Syynä on sekin, että HR näissä monisoluisissa eukaryosyyteissa on liian hidas prosessi ja voisi johtaa kromosomaalisiin translokaatioihin, koska niissä on laajempia DNA- toistojen homologisia fraktioita, mistä seuraa homologista cross over-reaktiota.

Koe-eläimellä HR-faktoreitten (RAD51, RAD51B, RAD51D, Xrcc2, Mre11, NBS1) puute voi johtaa embryoletaalisuuteen, poikkeuksena tekijät ATM, RAD52, RAD54. Tästä päätellään, että on HR funktio on tärkeä.

HR tapahtuma ( kuva) : RAD 50, Mre11, NBS1 kompleksi resekoi 5´-päät. RPA suojaa 3´-päät. RAD51 sitoutuu 3´-päihin.

RAD51, RAD 52 ja RAD 54 stimuloivat homologien etsintää ja haaran migraatiota. Homologiset ketjut syntetisoituvat.

Ligaasi siloittaa korjautuman ja kromatidit erottautuvat. Ketjut ovat korjautuneet ( error-free)

(Kts. kuvia NHEJ ja HR DSB-korjaustapahtumista: . Kaffeiinin vaikutus johtaa tilanteeseen decreased resection, kuten alhaalla oikealla olevassakuvassa). http://www.nature.com/nrm/journal/v14/n3/fig_tab/nrm3523_F2.html

• Katso NBS1 geeni.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15493328
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4683

• Sae2 nukleaasi

J Biol Chem. 2015 Sep 18;290(38):22931-8. doi: 10.1074/jbc.R115.675942. Epub 2015 Jul 31.

DNA End Resection: Nucleases Team Up with the Right Partners to Initiate Homologous Recombination.

Cejka P¹. Abstract

The repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination (HR)  commences by nucleolytic degradation of the 5'-terminated strand of the DNA break. This leads to the formation of 3'-tailed DNA, which serves as a substrate for the strand exchange protein Rad51. The nucleoprotein filament then invades homologous DNA to drive template-directed repair. In this review, I discuss mainly the mechanisms of DNA end resection in Saccharomyces cerevisiae, which includes short-range resection by Mre11-Rad50-Xrs2 and Sae2, as well as processive long-range resection by Sgs1-Dna2 or Exo1 pathways. Resection mechanisms are highly conserved between yeast and humans, and analogous machineries are found in prokaryotes as well.
© 2015 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

KEYWORDS:

DNA end resection; DNA endonuclease; DNA helicase; DNA repair; nuclease; protein phosphorylation; recombination

  

Ajatuksia Tymiinistä(T) ja Urasiilista (U). Per Arne Aasin väitöskirjasta: UNG ja muiksta korjausmenetelmiä

Löysin Per Arne Aasin väitöskirjan DNA.n korjausmekanismeista  vuonna 2004 ja käänsin itselleni suomalaista sisältöä  tästä vaikeasta ja uudesta asiasta.  Voi ollt käsitysvirheitä ja käännösvirheitä joukossa
. Täytyy päivittää sitä mukaa kun valkenee. 2004-12-15. Myös omia ajatuksia tässä ohella  tymiinin aineenvaihdunnasta. 14.10.2015.

Urasiilin poispoiminta DNA:sta

A-T, G-Covat Watson Crick- parit, joihin  U eivät  kuulu DNA:ssa 

 ( Vanhaa tietoa kertaan Harperin biokemiasta)

Puriini ja pyrimidiinirakenteitten aineenvaihdunnasta (Harper)  

voi löytää seikkoja, jotka heijastuvat jopa uusimpiin löytöihin DNA-ja RNA- materian tutkimuksissa. Vahva ”tippuminen”, ”vanheneminen”, urasiiliksi (U) päivittäin sytosiinista (C) käsin, on erityisen huomiotaherättävä seikka, sillä siinä on tapahtunut molekyylityypin  vaihtuminen DNA-emäksistä RNA- emäksiin keskellä DNA- materiaalia. Tämä taas rasittaa  korjausjärjestelmiä.

Epäsuora lisärasitus lie  sekin, että tymiini (T) on tavallaan ” kallis molekyyli”, arvokas lopputuotetila pyrimidiiniemästen anabolisessa rakentamisessa ( karbamylfosfaatti+aspartaatti; karbamylaspartaatti; dihydro-orotaatti; orotaatti; orotidylaatti; uridylaatti (UMP)- ja rekvisiittana sen muodostuksessa tarvitaan täyden varustuksen koentsyymit ja essentiellit vitamiinit, joista nyky-yhteiskunnassa ollaan kompromississa muutenkin. 

Cytosiininsynteesikartassa   tavataan mm muodot UMP; UDP; UTP + aminoryhmä, valmis CTP 

Tymidiinin kehittymisessä mm tavataan : UMP; UDP (reduktaasi); dUDP, dUMP (aktiivi metyyli, -CH3, B12, foolihappo; dTMP tymidylaatti, dTTP).

Jotta aineenvaihdunnan urasiilirakenteesta sen latauduttua fosfaateilla (UMP, UDP, UTP) voisi muodostua jälleen tymiiniä, vaaditaan kohtalaisen hyvä energiatila, tarpeeksi proteiinia ja proteiinilähteitten koentsyymejä B12 vitamiinia ja foolihappoa sekä aktiiveja metyylejä (SAM, S-adenosylmetioniinia) ja vitaalit entsyymit. Tokko  sellaista aineenvaihon huippua ja  synteesitehdasta on tuman puolella,  joten tuman puolen ongelma on urasiilin kertymä. On  eräs  kiertotie saada tuman puolella tymiiniä, cytosiinin metyloitumistien kautta, josta alla mainitaan. .

Cytidiinistä ( C ) taas tulee helposti urasiili (U) , kun vain yksi aminoryhmä poistuu ( deaminaatiotapahtuma) ja se voi tapahtua jopa spontaanisti, itsestään. Metyloitunut sytiini (meC) taas spontaanideaminoituu tymiiniksi DNA:ssa.( Tämä voi olla salvage tie!( mielestäni) , sillä "kallista"  tymiiniä  tarvitaan replikaatioon tietysti oikeille paikoillekin). 

Urasiilin muodostuminen on pyrimidiinirakenteitten yksinkertaisin vaihe  ja siitä kehittyy eteenpäin sytosiini tai toista tietä tymiini. Joten spontaani putoaminen urasiiliin heijastaa sekä huonoa energistä tilaa kehossa, että DNA:n degeneraatiosuuntaa. Mutta   organismilla on erittäin eleganttia  ” targeted”, tarkoituksellista urasiilinmuodostusta myös sytosiinista käsin.

(Omia pohdintoja:
 Urasiili hajoaa helpommin ja erittyy kehosta vaivattomammin kuin tymiini, joka on vaatinut myös jo rakentuakseen melkoisen hyvät olotilat ja myös sen  rakenteen hajoittamiseenkin vaaditaan samat ”paremmat” olotilat, sillä sen lopputuotteen muodostus  kuten sen oma muodostus vaatii B 12-vitamiinia. Tymiinin pyrimidiinirakenne hajoaa lopulta  BAIB tietä ja menee samaa rataa (kuten valiini ja propionihappo) kohti sitruunahappokiertoa, eli tarvitsee tavalliseen tapaan B12 vitamiinia ja biotiinia muuttuakseen metylmalonisemialdehydistä otollisempiin molekyläärisiin muotoihin.  Tässä taitaa olla ( näin arvelen) itseään negatiivisella feedbackilla säätelevä  mekanismi mukana, mikä lopulta vaikuttaa genomin miljööperäiseen  yleisikään ja miljööperäisen apoptoosin käynnistymiseen muutenkin. 

Onkohan aivan varmasti selvillä kehon proteiinin tarve? Koko ajan  löytyy lisää niitä DNA-replikaatiolaitteen tarvitsemia proteiineja. Vaatimus tymidiinin aineenvaihdunnan adekvaatista toiminnasta alusta loppuun voi olla jokin kynnys  joka loputla säätelee Genomisia replikaatio ja trqanskriptiotahteja- tietysti- Karjan "Födafaktor" tunnetaan- mutta ihmisintelligenssiä ja ihmis-ikää kohentava   "födafaktor" ei ole aivan selkeästi tiedossa, mutta sitä hahmotetaan jatkuvasti.   Ja jos genomin replikaatio/korjaus  ei voi toimia adekvaatisti , voi olla atoksisempaa tiputtaa urasiilit pois kompromissina- esim. tymiinin aineenvaihdunnan vajeen toksisuuden vältössä. Esim B12 vajeen oireet ovat  astettaisia samoin tymiinin aineenvaihdunnan myrkyttyminen.   Tymiinin adekvaatin toiminnan mahdollisuus on näkymätön asia kuin jäävuoret- jossa huippu näkyy , se  on urasiilin progressiivinen  tippuminen pois DNA:n funktionaalisesta  pyrimidiinikartasta.  Puriinin ongelmat tiedetään: kihti jne, mutta pyrimidiinin ongelmat  ovat  se näkymätön. urasiilin muodostus  on  ehkä  suojatie toistaiseksi). 

( Elinikää varmaan teoriassa pidentää, jos BAIB saadaan vaikka erittymään sellaisenaan kehosta. BAIB erittyy ilm. suurella osaa kiinalaisista ja japanilaisista sellaisenaan, joten heillä on genomia suojeleva aineenvaihdunnallinen sivutie käytössä. Tämä taas poistaa olettamani negatiivisen feedbackin DNA: tymiinilta. Tällöin genomin ei tarvitse syöttää – paremman puutteessa- ensimmäistä lähinnä tymiininkaltaista replikoitavaksi.

 Intrasellulaarisesti vallinnee vakiotasapaino dUTP ja dTTP välillä. dUTP-pitoisuus on 0,1%-1% dTTP-pitoisuudesta, kirjoittaa P Aas. Jos replikaation kiireessä puuttuu dTTP - mitä  varmaan relatiivisesti  puuttuu nykyaikana monelta -  on todennäköistä, että dUTP inkorporoituu. ”dUTP on hyvä substraatti DNA polymeraaseille”- kirjoittaa P Aas. U emäs tekee parin A- emäksen kanssa, joten asia ei ole kovin pahasti mutageeninen. Mutta pahempi seikka on se, että esiintyessään DNA:ssa U sotkeutuu promoottorielementteihin sitoutumalla sääteleviin proteiineihin. Korjausjärjestelmä taas on proteiineja, joita tarvitaan tarkempina enemmän kun on enemmän tarkkaa korjattavaa, ja siten voi taas tulla enemmän korjattavaa, kun tarvitaan enemmän korjaavia proteiineja. 

 

1960- luvun Harper mainitsee amerikkalaisesta aineistosta, että 25 % niistä, joilla erittyi BAIB, tymiiniaineenvaihdunnan lopputuotetta beta-aminoisovoihappoa, oli joku esi-isistä kiinalainen tai japanilainen ja kyse oli terveistä henkilöistä ja mahdollisesti resessiivisestä geenistä. Tähän seikkaan kannattaisi kiinnittää huomiota: BAIB-määrä on mitattavissa. samoin  B12 ja foolihappomäärät ovat myös mitattavissa- tosin  kiinnitetään huomoota vain veriarvoihin aikka B12 tarvitaan sekä aivojen autonomassa,, lihaskudoksessa,  soluissa. joten puute on monen asteista, ja veressä esiintyvä  arvo ei  kerro esim aivojen ja lihasten B12  statusta. Ei myöskään tymiinin synteesistatusta. Ehkä tymiinin metaboliastatuksen voisi kuvantaa jase  voisi merkitä Genomin  replikaation etc.   riittävää tymiinin saantia jos tymiinin katabolia   on normaali.   Verenmuodostukseen voi olla B12 ja foolihappoa  riittävästi nipin napin.  . Jos tymiinin aineenvaihdunnalliset seikat ovat esteettömät kaikin puolin, mutaatiofrekvenssi ja korjausjärjestelmien rasite pienenee. Urasiilin katabolia-alue eroaa tymiinin katabolia-alueesta. Jos nyt itse Kiinassakin olisi 25%:lla kyky erittää BAIB, se olisi jo melkoinen määrä ihmiskuntaa, eikä seikka näytä ainakaan olevan kansan lukumäärälle negatiivinen. 

Tymiini on tyyppi esimerkki " pahan kierteen" molekyylistä., " ond cirkel".  

Kun Genomissa tymiiniperäisen emäksen sijaan on tullut urasiiliperäinen emäs, on  olemassa korjausjärjestelmiä nyhtämässä ja niistämässä  pois urasiileja. Muuten tapahtuu lopulta suurempi mutaatio:  G:C pariutumisen sijasta transitioissa A:T.

 UNG geeni , Urasiili- DNA-glykosylaasi.

On olemassa pieniä proteiineja, joita koodaa UNG geeni ( Uraciili DNA glykosylaasit) .Nämä glykosylaasit eivät saa rikkoa RNA:n rakenteita eivätkä ne otakaan niitä urasiileja, jotka ovat muodossa dU, dUMP, U tai RNA. Vaan niillä on UDG-aktiviteetti, U-Dna-glykosylaasi

Urasiilin poistaminen  DNA.sta kuuluu DNA:n korjausmekanismeihin

DNA REPAIR MECHANISM on kappale sinänsä, mutta tässä keskityn vain urasiiliasiaan, joka on kappaleen alaotsikkoja.

 Siis urasiileja tulee sytosiineista  (c )  deaminoitumalla spontaanisti päivittäin 100-500 kpl ihmissolussa. Sytosiini on suojatumpana dsDNA:ssa (DNA:n kaksoishelixissä) kuin ssDNA:ssa (yksinkertaisessa DNA juosteessa) ja  se deaminoituu 100 kertaa nopeammin  yksinekertaisessa juostessa, ssDNA:ssa.

 Lisäksi DNA:ssa 3 % sytosiinista ( C )  metyloituu 5-asemaan ja 5-meC puolestaan deaminoituu  3-5 kertaa nopeammin kuin sytosiini, joten tulee tymiiniäkin. : Mutta tämä tymiini taas aiheuttaa T:G mismatch-tilanteen, ellei korjaanu ennen replikaatiota.

(Mutta nyt urasiilin puolelle).

UNG-proteiinit (uracil DNA glykosylaasit) voivat scannata  DNA:ssa ilmenevän U- nukleotidin. 

ovat kooltaan 19-35 kDa ja niillä on suuri  turnover- nopeus verrattuna muihin glykosylaaseihin. Urasiili poistuu nopeammin U:G parista kuin U:A-parista.  Urasiili, joka sijaitsee DNA:n 3´-päässä (OH- päässä) on myöskin huonompaa substraattia UNG-proteiineille kuin 5´-urasiili (fosfaattipäässä sijaitseva) jolloin desoxyriboosi (sokerirengas) on fosforyloituna. Tätä korjaavaa entsyymiä estää urasiili, urasiilianalogit 6-aminourasiili ja 5-azaurasiili.

UNG (glykosylaasientsyymi) sitoutuu ja scannaa DNA:ta pitkin pientä kuoppaa ja havainnee paikallisen helixheikkouden nappaamalla fosfaattirungosta. Kun UNG tapaa urasiilin, se taivuttaa DNA- runkoa 45 astetta ja aiheuttaa urasiilin irtautumisen helixistä ja putoamisen entsyymitaskuun. Vako on positiivisesti varautunut. Entsyymin leusiini272- sivuketju pitää sijaa rällä  tyhjällä emäspaikalla kuin ” tikkua ovenvälissä” tukeakseen extrahelikaalista konformaaiota. Urasiili roteerataan 90 astetta desoksyriboosin suhteen, jolloin glykosyylisidos destabilisoituu ( tulee epävakaaksi)  eikä DNA enää vedä sitä. (”Pinch-push-pull” on glykosylaasin mekanismi, jolla se nyhtää  urasiilin irti). Lisäksi AP- (apyrimidiini) kohta saa suojaa, kunnes endonukleaasi (APE1) ehtii sinne korjaamaan paikalle oikean emäksen,  

UNG-proteiinit ovat ERITTÄIN spesifisiä glykosylaaseja, mutta voivat vapauttaa DNA:sta myös joitain cytosiinin oksidaatiotuotteita kuten alloksaania, isodialuric-happoa, 5-hydroxyurasiilia ja 5-fluorourasiilia.

UNG-proteiinit omaavat myös erityisiä piirteitä verrattuna muihin glykosylaaseihin. Niiden aktiviteetti on 2-3 kertaa suurempi  ykinkertaista DNA-juostetta, ssDNA:ta kohtaan kuin dsDNA:ta , kaksinkertaista juostetaa kohtaan, mikä on tietysti edullinen seikka, koska ssDNA stabiliteettikin on heikompi.

UNG2 on tärkeimpiä näistä glykosylaaseista ja toimii tumassa.

UNG geenin lokalisaatio kromosomiasemassa 12q24.1.

Kooltaan UNG1 on 304 aminohappoa ja UNG2 on 313 aminohappoa.

UNG1 on mitokondriaalinen ja UNG2 on nukleaarinen ja sijaitsee replikaatio fokuksissa ja sillä on interaktiota replikaatioproteiinin A (RPA) ja muiden DNA-korjausproteiinien kanssa. Sillä on interaktio PCNA:n  kanssa ( proliferating cell nuclear antigen), joten arvellaan että se sijaitsee aivan juuri siinä, missä uusi DNA on replikoitumassa, replikaatiohaarukan edessä tai voi poistaa urasiilia (U) juuri muodostuneesta (nascent) DNA:sta. Tämä sopisikin siihen seikkaan, että urasiilin poistokyky on nopea ja mahdollisesti UNG2 pysyy samassa tahdissa nopeasti liikkuvan replikaatiohaarukan kanssa

UNG1 mRNA esiintyy kaikissa kudoksissa, eniten mitokondriapitoisissa, kuten lihas ja sydän. 

UNG2 mRNA taas esiintyy kudoksissa,  missä soluproliferaatio on korkea.

Urasiili-DNA-Glykosylaasiaktiviteetti

UDG-aktiviteetti on osoittautunut olevan solusyklin säätelemä seikka, pääsäätö tapahtuu transkriptiotasossa. UNG1-mRNA ja UNG2-mRNA säätyvät solusyklistä käsin. Myöhäisessä G1/ S faasissa säätyy nämä 2,5- ja vastaavasti 5- kertaisiksi pitoisuuksiltaan. 

Tätä seuraa UDG-aktiviteetin nousu 4-5 kertaiseksi myöhäis S- vaiheessa verrattuna alkavan G1 vaiheeseen. S- faasin jälkeen UNG2 mRNA alenee nopeasti ja UNG1 mRNA hitaasti.

 Siis: Kun on replikaatio, niin silloin UNG alkaa toimii tehokkaasti.

Miksi tämä UNG- geenifunktio on tärkeä? Immunologisen pätevyyden ja plastisuuden takia

Puhutaan V(D)J rekombinaatioista luuytimessä. 

B-lymfosyytit tekevät antibodeja ja antibodimuodostus taas tarvitsee omat vaihteensa, joka käyttää geneettistä taustakoneistoa. 

Class switch recombination (CSR) tarvitaan immunoglobuliinigeenien taustalla. B-solut omaavat tietyt geneettiset potentiaalit, kun ne ovat kypsiä ja itukeskuksissa kehossa. Niiden DNA:ssa on mahdollisuuksia äärimmäisiin erilaistumisiin, CSR-funktion  lisäksi on somaattisia hypermutaatioita (SHM) taustalla. Mm. näistä kahdesta seikasta seuraa B-solujen kyky tehdä erilaisia antigeenivasteita peruslukemilta: IgM, IgG, IgA, IgE.

Tarkoituksellinen aktivaation indusoima deaminaatio tuotaa urasiilin. 

Jos tekijä AID ( activation induced deaminase, targeted, tarkoituksella tehdyn urasiilin muodostus!) puuttuu, kehittyy liikaa IgM-tyyppistä immunoglobuliinia   (CSR ja SHM funktioita  ei esiinny), sekundaari lymfakudos on proliferoitunutta. 

 Saman tapaista aiheuttaa, jos UNG2- vajetta esiintyy. (CSR on häiriintynyt ja SHM puutteellinen) 

Tässä tarkoituksellisessa  sytosiinin deaminaatiossa urasiiliksi (AID)   on kyse tilanteesta, missä Cytosiinin muutosta Urasiiliksi keho käyttää hyödykseen  tehdessään kohde-DNA.ssa, ( target DNA) merkin joka toimii lopulta vaihteena:  UNG2 tekee Abaasisen kohdan, joka voi prosessoitua molemmat vastaavat DNA-emäkset poistavaksi hyvänä merkkinä vaihdealueessa, stanssi! ,  (ja itse asiassa minimaalinen DSB) ja  NHEJ korjausjärjestelmä liittää   päät kuten V(D)J- rekombinaatiossa (NHEJ, non- homologous end-joining). Tämän function vaurio altistaa bakteeritulehduksille. 
 (Huomn.  NHEJ funktio taas tarvitsee tarkentajana IP6-tekijää, joka on ravintotekijä. 14.10.2015).

Muut Urasiili -DNA Glykosylaasit (UNGs)

In vivo on muitakin UDG aktiviteettia omaavia entsyymeitä urasiileja irrottamassa kuin e.m. UNG- geenin koodama UNG. On mainittava ainakin kolme muuta: TDG, SMUG1 ja MBD4, jotka pystyvät ottamaan urasiileja pois DNA:sta. Ne poistavat myös eräitä urasiilianalogeja kuten 5-hydroksymetylurasiilia, 3,N-etenosytosiinia, 5-fluorourasiilia. (UNG2 ja SMUG1 poikkeavat muista glykosylaaseista siinä, että ne pystyvät irrottamaan korkeammalla aktiviteetilla U:n ssDNA.sta).

SMUG1 (1999, 2001,2003)

on Single- strand selective monofunctional Uracil-DNA glykosylase ( 1999) . Nimi on sikäli erheellinen että se ottaa urasiilia sekä U:G että myös U:A- pareista. Poistaa myös 5-hU ja 5-foU.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 12q13.1-q14.

Koko 270 aa.

TDG (1993, 2002)

on T(U)mismatch glykosylaasi, joka ottaa pois T tai U-emäksen dsDNA- mismatch tilanteessa. Entsyymi hoitaa ensisjaisesti U:G mismatch ja sitten T:G mismatch- tilanteen. TDG on reportoitu transkriptiotekijäksikin.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 12q24.1.

Koko 410 aa.

MBD4, myös käytetään nimeä MED1 (1999, 2001)

Tämä ” methyl- binding domain protein 4” on monofunktionaalinen glykosylaasi, joka sitoutuu T:G tai T:U mismatch kohtiin ja vapauttaa T tai U näistä kohdista. Se kiinnittyy myös metyloituneeseen DNA:han in vitro ja saattanee vastavaikuttaa siihen mutageenisyyteen, mikä seuraa 5-metyylisytosiinin (5-meC) deaminoituessa tymiiniksi (T).

Tämän entsyymin kunto on syövän suhteen estävä seikka (1999)!

Entsyymissä on glykosylaasi-domaani ja erillinen metyyliä sitova domaani. Tässä on kohta, joka on onkologian suhteen tärkeä.

Sijainti genomissa kromosomiasemassa 3q21.22.

Koko 580 aa.

Yhteenveto siitä, miten urasiilia tai hydroxymetylurasiilia voi korjata pois genomista

Replikoitumattomasta tai replikoituvasta osasta.

( Tri P Aas piirsi tästä kuvan)

Nukleoplasmi / nukleoli, replikoitumattoman osa korjaus 
 

a. Tymiinin (T) oksidaatiosta on tullut 5-HmU:A

Tymiinin oksidaatiosta ja deaminatiosta  on seurannut 5-meC ja täten 5-meU:G

Tilanne: Kromatidissa esiintyy parit HmU:A ja HmU:G.

Korjaus: SMUG1

Short patch BER (Base Excision Repair): APE1 (AP endonukleaasi) , polymeraasi beetta, XRCC1, LigaasiI, Ligaasi III

(BER-tie poistaa solusta päivittäin 10 000 DNA leesiota)

b. Cytosiinin ( C ) deaminaatiosta on seurannut dsDNA tai ssDNA:ssa virhe urasiili.

Tilanne: U:G mismatch

Korjaus UNG2 ( nukleoplasma);

SMUG1 ( nukleoli),

MBD4 (MED4, methyl binding domain4),

TDG; T(U) mismatch glykolase)

Short patch BER: APE1, polymeraasi beetta, XRCC1 ( BER- koordinaattoriproteiini),

Ligaasi I ja Ligaasi III

Multiproteiinikompleksi UNG2:n kanssa.

Replication foci, Replikaatiokohdan korjaus

a. Cytosiinin deaminaatio ssDNA:ssa tapahtunut.

Tilane: esiintyy U

Korjaus: UNG2

Urasiilin excisio, poistaminen UNG2-entsyymillä; haarukan regressio tai rekombinaatio käyttämällä informaatiota sisarkromatidista, joka tässä kohdassa nyt on kapeasti ds; tai transleesiosynteesi (TLS)

b. Replikaation tapahtuessa inkorporoituu vahingossa dUMP.

Tilanne: tulee epäsopiva pari U:A mismatch

Korjaus: UNG2

Long patch BER: APE2 (?),

Polymeraasi delta ja epsilon, PCNA, FEN1 (flap endonuclease 1) , Ligaasi I.

(DNA-korjausmekanismeista teen suomalaista yhteenvetoa tästä allaolevasta lähteestä)

Lähde:

1. AAS PER ARNE

(NTNU 2004 Norwegian Cancer Society)

Macromolecular maintenance in human cells - Repair of uracil in DNA and methylations in DNA and RNA

2. Harper::Review of physiological chemistry

Taustaa(3). Kemian Nobelin palkinnon saaja professori Paul Modrich. MMR Mismatch Repair mekanismin

 Professori Paul Modrich on amerikkalainen, syntynyt 1946. Fil tri 1973 Stanfordin Yliopistosta Kaliforniasta  Hughesin Lääketieteellisen Instituutin tutkija, Biokemian professori Duken Yliopiston Lääketieteen Instituutissa,   NC, USA. 
 https://www.hhmi.org/research/dna-mismatch-repair-and-genetic-stability

• Paul Modrich osoitti solun jakautumisen aikana tapahtuvan DNA:n korjausmekanismin, väärin pariutuneitten nukleotidien korjaamisen. mismatch repair (MMR) . Mismatch korjausjärjestelmän olemassaolo vähentää DNA:n kopioimisessa tapahtuvia virheitä noin tuhatkertaisesti. Mismatch-virheitä aiheutuu m.m. eräässä perinnöllisessä   suolistosyövässä.  Vuoden 2015 Nobel-palkinnonsaajat antavat perustavaa tietämystä  solun toiminnoista ja sellaista tietoa, jota voi hyödyntää uusien syöpähoitojen kehittämiseen.

Paul Modrich har visat hur cellen korrigerar felaktigheter som uppstår när DNA kopieras under celldelningen. Mekanismen, mismatch repair, minskar DNA-kopieringens felfrekvens ungefär tusen gånger. Medfödda fel i mismatch repair orsakar bland annat en ärftlig form av tarmcancer.

2015 års Nobelpristagare i kemi har gett oss grundläggande insikter i hur celler fungerar, kunskaper som till exempel går att använda för att utveckla nya cancerbehandlingar. 
 

http://www.kva.se/globalassets/priser/nobel/2015/kemi/sciback_ke_en_15.pdf

MMR  

• DNA:n replikoituminen ei ole virheetön tapahtuma. Aina on mahdollisia, että synteesin aikana tulee jokin virheellinen nukleotidi uuteen DNA-säikeeseen oikean parin sijasta. (Oikeita pareja DNA-säikeessä muodostavat Watson Crick emäsparit A-T ja G-C ). Tuloksena väärästä parista muodostuukin Ei-Watson-Crick- emäspari ja silloin kauniiseen DNA-kaksoissäikeen helixrakenteeseen tulee jokin poikkeava hahmo. Tämän tyypin virheitä sanotaan mismatch- virheiksi ,yhteensopimattomuuksiksi, ja sellaiset voivat aiheuttaa DNA-sekvenssissä muutoksen, esim. siitä johtuu mutaatioita.
• Ensisijaispuolustuksena tällaista yhteensopimattomuutta vastaan replikoituvat DNA-polymeraasit sisältävät jo itsessään 3´-5´´- exonukleaasiaktiivisuutta, jonka avulla ne voivat saman tien oikoluke( korrektuurilukea) proofread- vastasyntetisoitua DNA-säiettä. Tämä heti oikova  aktiviteetti voi korjata virheen DNA-replikaation aikana kääntämällä polymeraasin suuntaa ja leikkaamalla virheellisesti johdetut nukleotidit pois. Vaikka oikoluku  tehokkaasti korjaakin useimmat virheet joita DNA-synteesin aikana tapahtuu, joitain ei-Watson-Crick-emäspareja kuitenkin jää jäljelle. 

As noted above, the DNA replication machinery is not error-free. There is always the possibility

that an incorrect nucleotide is introduced during synthesis of a new DNA strand. As a result, a

non-Watson-Crick base pair is formed, which distorts the double-stranded DNA helix. These

types of errors are known as mismatches and they have the capacity to change the sequence

of DNA, i.e. to introduce mutations.

As a first line of defence against mismatches, replicating DNA polymerases contain a 3′to 5′exonuclease activity that allows them to pro-of-read the newly synthesized DNA strand [49]. The exonuclease activity can correct mistakes during DNA replication by reversing the direction of the polymerase and excising incorrectly introduced nucleotides. Even if proofreading efficiently corrects most mistakes made during DNA synthesis, some non-Watson-Crick base pairs still remain.

Miten DNA toimii jos on tullut pysyvä virhe 

• On laskettu, että replikoivat DNA-polymeraasit, joilla on purkaus- ja heti- korjaus-kykyä omaavat in vitro virhetiheyden 5 x 10E(-5). MMR alentaa virhetiheyttä merkitsevästi ja mutaatiotiheyttä esim ihmisen itusoluissa arviolta määrään 1x 10(-8) emäsparia kohden solusukupolvessa
•  Varhaisimmat MMR tutkimukset teki geneetikot, joita kiinnosti rekombinaatio. Robin Holliday teki oletuksen, että eri DNA-juosteitten keskiset heteroduplexit muodostuisivat rekombinaation aikana. Niitä mismatcheja, joita tällä tavalla muodostui, täytyi jonkin laadun solusysteemin korjata johtaen geenin konvertoituminen. Todellakin, jos transfektoitiin lambda fagin DNA:n heteroduplex molekyylejä E. Coli bakteeriin, seurasi mitsmatchien korjaantumisia, mutta siihen vaikutukseen tarvittavaa entsyymisysteemiä ei tunnettu. 
• Vuonna 1976 tuli uusi edistysaskel, kun Robert Wagner ja Matthew Meselson raportoivat , että saman DNA heteroduplexin kahden tai useamman lähellä sijaitsevan kohdan korjaantuminen tapahtui useammin samassa säikeessä kuin vastapäisessä säikeessä.

To correct these errors, cells use mismatch repair. It is estimated that that replicative DNA polymerases with proofreading in vitro have error frequencies of about 5 ×10-5.

Mismatch repair lowers this frequency significantly and the mutation rate in for example human germ cells is estimated to be close to 1 ×10-8 per base pair per generation [50].

The early studies of mismatch repair were mainly carried out by geneticists interested in recombination. Robin Holliday had hypothesised that heteroduplexes between different DNA strands would be formed during recombination [51]. The mismatches formed in this way had to be corrected by some sort of cellular system, leading to gene conversion. Indeed, transfection of

heteroduplex molecules of lambda phage DNA into E. coli led to repair of the mismatches, but the enzymatic system required for this effect was unknown.

An important step was taken in 1976, when Robert Wagner and Matthew Meselson reported that repair of two or more close sites on the same heteroduplex DNA molecule occur more often on the same strand than on the opposite strand [52].

• Tästä havainnosta tehtiin oletus, että mismatch-korjaantumismekanismi kohdistuu yhteen juosteeseen juostespesifisesti, jolloin salliutuu pitkien DNA jaksojen korjaantuminen. He myös punnitsivat sitä mahdollisuutta, että juostespesifistä MMR mekanismia voi käyttyä korjaamaan ei-kanonisia emäspareja, joita DNA-synteesin aikana muodostuu. Korjauskoneisto voisi ohjautua vastareplikoituneelle säikeelle joko jossain erityisessä suhteessa replikaatiokoneistoon tai sitä ohjaisi vastasyntetisoituneen säikeen alimetyloitunut tila. E. Colissa DNA on normaalisti metyloitunutta molemmista säikeistään GATC-kohdilta, mutta juuri kun DNA on syntetisoitumassa niin vastasyntynyt säie on alimetyloitunutta sellaisen ajanjakson, mikä voisi sallia MMR- koneiston erottaa vastasyntetisoituneen ja templaattina toimivan DNA-säikeen toisistaan. Tätä havaintoa tuki sellainen vuonna 1975 tehty huomio, että solun DNA-metylaasin ( entsyymin, joka lisää metyyliryhmän GATC- jakson adeniiniin) puuttuessa E-Colin mutaatiotiheys oli suurempi .
• Mismatch -korjausmekanismin genetiikka selkiytyi yhä paremmin, kun Barry W. Glickman ja Miroslav Radman osoittivat metylaatio-ohjattuun DNA MMR -korjausmekanismiin tarvittavat geenit (mutH, mutL, mutS, uvrD)

This observation led them to propose that mismatches are repaired by a strand-specific mechanism directed towards one strand, which allows for repair of long DNA tracts. They also speculated that strand-specific mismatch repair could be used to correct non-canonical base pairs formed during DNA synthesis. The repair machinery could be guided to the newly replicated strand either via a special relation to the replication machinery or directed by under-methylation of n the newly synthesised strand. In E. Coli DNA is normally methylated on both strands at GATC-sites, but during DNA synthesis the nascent strand is unmethylated for a period of time [53], which could allow the mismatch repair machinery to distinguish newly replicated DNA from the template DNA strand. In support of this notion, loss of cellular DNA methylase, the enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence GATC, was already in 1975 shown to cause higher mutation rate in E. coli [54]. The genetics of mismatch repair was further clarified when Barry W. Glickman and Miroslav Radman could demonstrate (Sivu 10) that mutH, mutL, mutS and uvrD genes were all required for the methylation-instructed DNA mismatch correction [55].

• Suoraa näyttöä metyylien ohjaamasta MMR korjausmekanimsista saatiin vuonna 1983. Ensin Paul Modrich ja Matthew Meselson käyttivät heteroduplex- konstruktiota ja DNA-metylaation määriteltyjä tiloja osoittaakseen, että todellakin DNA-metylaatio ohjasi juostespesifisesti väärinpariutuneen emäksen eliminaatiota kolibakteerissa. Modrich kehitteli edelleen menetelmän, joka salli DNA MMR korjausmekanismin analyysin soluttomassa E.Coli -uutteessa. Menetelmässään Modrich käytti bakteerifagi-heteroduplexeja, mutta johti mismatchit toisiaan peittävillä sekvensseillä, joita tunnisti kaksi erilaista katkaisija- endonukleaasia ( restriktio-entsyymiä) . Noin 1000 emäsparia (bp) tästä mismatch -kohdasta oli GATC- metylaatiokohtaa, jota saattoi kontrolloidusti metyloida ja täten käyttää monitoroitaessa juostespeisfistä korjausta. Tätä menetelmää käyttamällä Modrich pystyi osoittamaan, että korjausaktiivisuus riippui ATP-energiasta ja heteroduplexin metylaatiotilasta. Hän osoitti samalla, että kaikki mutaatiot, jotka olivat kohdanneet geenejä mutH, mutL, mutS ja uvrD- heikensivät MMR- järjestelmää soluvapaassa E- Coli- uutteessa. Tällä elegantilla menetelmällään Modrich saattoi tutkimustyösarjassaan eristää erilaisten korjausgeenien tuotteita miltei homogeenisyyteen saakka, identifioida proteiineja ja tutkia niiden ominaisuuksia in vitro hyvin yksityiskohtaisesti.

Direct evidence for methyl-directed repair of mismatches came in 1983. First, Paul Modrich and Matthew Meselson used heteroduplex constructs with defined states of DNA methylation to demonstrate that DNA methylation indeed directed strand-specific elimination of mismatches in E. coli [56]. Furthermore, Modrich developed an assay that allowed analysis of DNA mismatch repair in cell-free E. Coli extracts [57].

In his assay, he used the classical bacteriophage heteroduplexes, but introduced mismatches within overlapping sequences recognised by two different restriction endonucleases. About 1,000 bp from the mismatch was a GATC methylation site, which could be methylated in a controlled way and thus used to monitor strand-specific correction. Using the assay, Modrich could demonstrate that the repair activity was dependent on ATP, the methylation state of the heteroduplex, and that mutations affecting mutH, mutL, mutS, and uvrD all impaired mismatch repair in cell-free E. coli extracts. With the help of this elegant assay, Modrich could in a series of papers isolate the products of the different repair genes to near homogeneity, identify the proteins and investigate their properties in vitro in great detail [58-60]. 
 

• Modrichin työ huipentui vuoden 1989 perustavaa laatua julkaisuun: hän saattoi lopulta saada aikaan toistettavasti DNA mismatch- korjaantumisen määritetyssä in vitro systeemissä. Tässä julkaistussa työssään Modrich osoitti mismatch -korjausjärjestelmän vaativan DNA polymeraasia III-entsyymin, exonukleaasi I - entsyymin ja DNA- ligaasin. Sitten hän kombinoi nämä tekijät puhdistettuihin MutH, MutL, MutS ja UvrD proteiineihin ja yksijuosteista DNA:ta sitovaan proteiiniin. Nämä tekijät yhdessä pystyivät prosessoimaan väärin pariutuneita emäksiä (mismatch-kohtia) juostespesifisellä tavalla in vivo. Proserssia ohjasi yksittäinen GATC- sekvenssi, jossa oli yksi metylaatiokohta vain yhdessä juosteessa (hemimetyloitunut juoste) ja sijaiten kaukana virheellisestä emäksestä ( mismatch-kohdasta).

Modrich’s work culminated in a ground breaking paper published in 1989 [61], in which he could finally reconstitute DNA mismatch correction in a defined in vitro system. In the paper, Modrich demonstrated the requirement of DNA polymerase III, exonuclease I, and DNA ligase for mismatch repair. He then combined these factors with purified MutH, MutL, MutS, UvrD, and single-stranded DNA-binding protein. Together these factors could process mismatches in vivo in a strand-specific manner directed by the single, GATC sequence methylated on only one strand (hemimethylated) and located distant from the mismatch.

• Tässä ja muissa tutkimuksissaan Modrich osoitti, että MutS omaa ydintehtävän MMR- korjausjärjestelmässä, nimittäin MutS tunnistaa ja sitoo ei-Watson-Crick- emäspareja. Juostespesifisyyttä varmistaa se, että MutH sitoutuu hemimetyloituun GATC- kohtaan vastasyntetisoidussa DNA-juosteessa. MutL toimii välittäjänä, joka tekee vuorovaikutuksen MutH ja MutS proteiinien kesken. MutL johtaa signaaleja MutS: ltä, ja tästä seuraa latentin MutH-endonukleaasin toiminnan aktivaatio, mistä taas tulee rako (nick) vastasyntyneeseen DNA-juosteeseen aivan hemimetyloituneen GATC-kohdan lähelle. Nyt tämä koneisto tekee helikaasin (UvrD) kanssa interaktion. Ja se yhdessä MutS, MutL ja MutH proteiinien ksnssa erottavat kaksi DNA-juostetta toisistaan kohti virheellisen emäsparin ( mismatch) sijaintia. Mutantin säikeen poisiirtäminen paikaltaan jatkuu ja pysähtyy aivan mismatchin alavirran puolelle. Vastasyntetisoitunut (poistettu säie) korvataan aukkoa täyttävällä reaktiolla, johon osallistuu DNA pol III, joka käyttää templaattina parentaalista juostetta.https://www.youtube.com/watch?v=dgPh1qigv7s

In this and other studies, Modrich demonstrated that MutS, which recognises and binds to non-Watson-Crick base pairs, performs a core function in mismatch repair system. To confer strand-specificity, MutH binds at hemimethylated GATC sites on the nascent strand. MutL acts as a mediator, which interacts with both MutH and MutS. MutL transduces signals from MutS, which leads to activation of the latent MutH endonuclease activity causing a nick in the nascent DNA strand near the hemimethylated GATC-site. The machinery now interacts with a helicase (UvrD), which together with the MutS, MutL, and MutH proteins separates the two DNA strands towards the location of the mismatch. Displacement of the mutant strand continues past, and halts just downstream of, the mismatch. The nascent strand is then replaced by a gap-filling reaction, in which DNA polymerase III uses the parental strand as a template.

Entä MMR korjausmekanismi nisäkäskehossa?

• Myöhemmin Modrich et al. onnistuivat osoittamaan MMR- korjausjärjestelmän olevan konservoitunut myös eukaryoottisessa solussa. Vuonna 2004 Moldrich pystyi saamaan aikaan ihmisen MMR- korjausjärjestelmän pelkillä puhdistetuilla tekijöillä. Päinvastoin kuin E. Colissa DNA:n metylaatio ei ole suoraan johtamassa juostespesifistä DNA- korjausta eukaryoottisella solulla. Yksi mahdollisuus on, että juostespesifiset raot (nicks), joita muodastuu DNA-replikaatiossa, voisivat suoraan ohjata juostespesifisen virheen oikaisun. Tätä tukee huomio, että MMR on tehokkaampi replikaatiohaarukan viiveellä valmistuvassa  ( lagging, bottom) säikeessä ja pelkkä vako riittää suoraan säiespesifiseen korjaukseen in vitro.  ( Oma arvelu: lagging juoste  DNA tarvitsee enemmän MMR valvontaa struktuurisyistä)
• Eräs vaihtoehto on, että MMR saattaa olla DNA:ssa heti replikaation jälkeen väliaikaisesti esiintyvien ribonukleotidien ohjaama. ( Esim. Primeerit eli alokkeet ovat RNA-materiaalia replikaatiokuplassa).( Lagging säie on ”jäljessä tuleva juoste” ja se replikoidaan fragmentteina, Okasakin fragmentit, joilla on tietty välinsä ja ligaasit sitten sinetöivät osat yhtenäiseksi)  ( Oma arvelu: tässä on enemmän RNA alukkeita läsnä)
• Muista näkokohdsita katsoen eukaryoottinen MMR on lähisukua E-Coli-systeemille ja konservoituja hmologeja ovat sellaiset tekijät kuin MutS ja MutL. Nisäkkäitten MMR järjestelmän tärkeyttä painottaa se, että tässä tiessä ilmenevät puutteet aiheuttavat perinnöllistä ei polyposis-tyyppistä - colon syöpää.

Mismatch repair in mammalian cells.

https://www.youtube.com/watch?v=HYS6EKnQcv0

Later studies by Modrich and others have demonstrated the conservation of mismatch repair in eukaryotic cells and in 2004, Modrich managed to reconstitute human mismatch repair with only purified factors [62]. In contrast to the situation in E. coli, DNA methylation does not direct (11 sivu) strand specific DNA repair in eukaryotic cells. One possibility is that the strand specific nicks formed during DNA replication can direct strand-specific error correction. In support of this notion, mismatch repair is more efficient on the lagging strand at the replication fork [63], and a single nick is sufficient to direct strand specific repair in in vitro [62, 64]. Alternatively, the mismatch repair machinery may be directed by ribonucleotides transiently present in DNA after replication [65].

In other aspects, eukaryotic mismatch repair is closely related to the E. coli system with conserved homologues to key factors such as MutS and MutL. The importance of the mammalian mismatch repair system is under scored by the finding that defects in this pathway cause hereditary nonpolyposis colon cancer [66, 67]

Kemian Nobelin palkinnonsaaja Tomas Lindahl : Alkyloidun DNA:n korjausmekanismista . T Lindal konferenssi

Emeritusprofessori   Tomas Lindal
Tomas Lindahl, svensk medborgare. Ruotsin kansalainen
 Född 1938 (77 år) i Stockholm,  Sverige Syntynyt 1938 Tukholmassa., nyt 77 vuotias.
 Disputerad 1967 vid Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige. 
Väitellyt tohtoriksi 1967 Karoliinisessa Instituutissa.
 Professor i medicinsk och fysiologisk kemi vid Göteborgs universitet 1978–82.
 Vuosina 1978- 1982 Göteborgin Yliopiston  lääketieteellisen  ja fysiologisen kemian professori
 Emeritus group leader vid Francis Crick Institute och Emeritus director of Cancer Research UK vid Clare Hall Laboratory, Hertfordshire, Storbritannien.
Emeritus ryhmän johtaja Francis Crick-instituutissa ja Emeritus johtaja  Britannian syöpätutkimuksessa Clare Hall lboratoriossa, Hertfordshiressä.  

http://www.jbc.org/content/255/22/10569.long
Minkälaisia tutkimustöitä löydän  netistä Emeritusprofessori  Tomas Lindahlilta?  Tämän allaolevan linkin löysin M. Olssonin Facebook artikkelista.

Alkyloidun DNA:n korjaantuminen E. Colissa. O6-metyyliguaniinista siirtyy metyyliryhmä proteiinin cysteiiniin. 

Repair of alkylated DNA in Escherichia coli. Methyl group transfer from O6-methylguanine to a protein cysteine residue.

1. M Olsson and
2. T Lindahl

Tiivistelmästa suomennosta   (Abstract)

• Alkyloidusta DNA.sta näyttää 06-meG- tähteet katoavan  E.Colissa indusoidussa DNA:n  korjaussysteemissä.  Tätä reaktiota voi tutkia tarkemmin soluttomassa miljöössä käyttämällä radioaktiivisella metyloivalla agenssilla käsiteltyä DNA:ta substraattina. O6-meGg-katoamaa DNA:sta  ei seuraa radioaktiivisen materiaalin vapautuminen happoliukoisessa muodossa. Sen sijaan O6-MeG:n metyyliryhmä  näyttää siirtyneen entsymaattisesti proteiinin  Cys-aminohappoon. On havaittu radioaktiivisesti merkkautunutta S-metyylicysteiiniä proteiinihydrolysaateissa alkyloitua  DNA:ta inkuboitaessa. osittain puhdistetun E-Coli- metyylitransferaasin kanssa. Radioaktiivinen  aminohappotähde  osoittautuu identtiseksi  S-metyylicysteiinin kanssa.jos se oksidoidaan vetyperoksidilla, tulee S-metyyli cysteiinisulfonia

O6-Methylguanine residues disappear from alkylated DNA by an inducible repair process in Escherichia coli. The reaction can be studied in a cell-free system, using DNA treated with a radioactive methylating agent as substrate. The disappearance of labeled O6-methylguanine from DNA is not accompanied by release of radioactive material in an acid-soluble form. Instead, the methyl group of O6-methylguanine appears to be transferred enzymatically to a protein cysteine residue. Radioactively labeled S-methylcysteine has been identified in protein hydrolysates after incubation of the alkylated DNA with a partly purified E. coli methyltransferase activity. The radioactive amino acid residue shows properties identical with those of S-methylcysteine by automatic amino acid analysis and paper chromatography in several solvent systems. Moreover, oxidation of the compound with hydrogen peroxide yields a product which co-chromatographs with S-methylcysteine sulfone.

Tomas Lindahl Konferenssi DNA-korjausmekanismeista 

 http://dna.uio.no/lindahl/index.html
Konferenssin ohjelma on DNA- korjausmekanismiasioitten  pulssin tunnustelua:

 Tieteellinen aihe (suomennosta)  Scientific subject

• Tomas Lindal on tehnyt DNA:n korjaantumisen tutkimusalalla monta tieteen virstanpylvästä: tämän konferenssin tieteellisenä keskiönä on DNA:n korjantumisen perusasiat. Useimmat  mutageenit ja karsinogeenit aiheuttavat DNA- rakenteen   kovalentteja muutoksia. Niinpä elävä organismi on kehittänyt suuren joukon geenifunktioita, joiden spesifisenä tehtävänä on korjata tai sietää sellaisia muuntumisia elinkykyisyyden vioittumatta tai taudin kehittymättä. DNA:n korjaantumisen tärkeys normaalille olemassaololle on  todettu monesta  seikasta: On havaittu DNA:n  transkription ja DNA:n korjaantumisen välinen kytkeytyminen. On todettu  assosiaatio DNA:n korjaamisen   ja solusyklin  tarkistuskohtien (chekpoints) kesken.  On tunnistettu  ne geenit, jotka koodaavat nukleotidin (nt)  irrottamista (NER)  DNA-rihmasta  ja  huonosti pariutuvien  nukleotidien korjausmekanismia (MMR)   ja havaittu niiden olevan ihmiselle välttämättömiä  syövän ja neurologisen taudin estämiseksi. Viisikymmentä vuotta sitten tehtiin uutislöytöjä DNA:n korjaantumisesta ja niistä ajoista meidän päiviimme  DNA:n korjaantuminen  käsittää  tieteelliselle yhdyskunnalle moninaisia ja kehityksellisiä näkökohtia  suuresti merkityksellisessä  laajassa  tieteellisessä alueessa.

Tomas Lindahl made many landmark discoveries in DNA repair. The scientific focus will be on the basics of DNA repair. Most mutagenic and carcinogenic agents induce covalent changes in the structure of the DNA and living organisms have evolved a large number of gene functions specifically designed to repair or tolerate such alterations without loss of viability or development of disease. The importance of DNA repair for normal life existence has been verified by discoveries of coupling between transcription and repair, by association between DNA repair and cell- cycle checkpoints, and by identification of nucleotide excision and mismatch repair genes being essential for prevention of cancer and neurological disease in man. From the novel discoveries on DNA repair more than 5 decades ago, DNA repair today comprise diverse and evolving aspects of a broad scientific area of major significance to the scientific community.

Lindahl T. (2013) My Journey to DNA Repair. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 11(1):2-7. doi: 10.1016/j.gpb.2012.12.001

Programme 

(Kommenttini 13.10.2015 : Ohjelma antaa viitettä DNA:n  korjaantumista koskevan tieteen  nykyisistä keskiöistä ).

Wednesday, June 17th 2015
13:00	Lunch
13:00	Registration opens
Session I: RNA Metabolism et al
	Chair: Arne Klungland
15:00	Arne Klungland, Magnar Bjørås, Yungui Yang
	Welcome and introduction to session I
15:10	Mutsuo Sekiguchi
	Molecular tactics to escape treat of oxidative RNA damage
15:35	Nima Mosammaparast
	Ubiquitin-dependent mechanisms of alkylation repair regulation
16:00	Hilde Nilsen
	DNA and RNA quality control by SMUG1
16:25	Ingrun Alseth
	Human Endonuclease V as an inosine specific ribonulclease
16:40	Coffee
16:50	Yungui Yang
	Decipher the biological role of reversible RNA modifications
17:15	Roger Woodgate
	Utilization of Y-family polymerase steric gate mutants to uncover novel mechanisms of ribonucleotide repair
17:40	Hanna Delago
	The DNA repair factor SNEVhPrp19/hPso4 regulates cellular and organismal life span and promotes adipogenic differentiation
17:55	Simon Bekker-Jensen
	SCAI interacts with 53BP1 to promote heterochromatin-associated DNA repair and maintain genomic stability in vivo
18:10	Tapas
Session II: Evening Keynote Presentations
	Chair: Magnar Bjørås
19:00	Miroslav Radman
	Anti-oxidant protection and radiation resistance
19:30	Hans Krokan
	All the things U are
20:00	Matthias Meyer
	Post-mortem DNA damage – challenges to ancient DNA research
Thursday, June 18th 2015
07:30	Breakfast
Session I: RNA Metabolism et al
	Chair: Arne Klungland
09:00	Chuan He
	Oxidative demethylation of RNA in Biological regulation
Session III: Translesion synthesis and mutagenesis associated processes
	Chair: Richard Wood
09:25	Richard Wood
	Suppression of Chromosome instability by DNA polymerase Q
09:50	Graham Walker
	Translesion DNA polymerases: From cancer chemotherapy to bactericidal antibiotics
10:15	Robert Fuchs
	Damaged DNA Replication: how lesion tolerance pathways are interconnected in vivo
10:40	Coffee break
11:10	Arthur Grollman
	Signature mutation of a novel human carcinogen
11:35	Lawrence A. Loeb
	The Mutator Phenotype in Human Cancer
12:00	Eugenia Dogliotti
	Mitochondrial dysfunction in DNA repair defective disorders: mechanisms and pathological relevance
12:25	Matthias Altmeyer
	DNA strand breaks trigger phase transitions of intrinsically disordered proteins
12:40	Françoise Dantzer
	Poly(ADP-ribose polymerase 3 (PARP3) in epithelial to mesenchymal transition
13:00	Lunch
Session IV: DNA repair and disease
	Chair: Eugenia Dogliotti
14:00	Zhao-Qi Wang
	Life without proper DNA repair
14:25	Jan H. J. Hoeijmakers
	The overwhelming role of DNA damage in the process of ageing
14:50	Alan Lehmann
	Genetic and clinical heterogeneity in the XP population in the UK
15:15	Francesco Blasi
	Prep1 (pKnox1) tumor suppressor prevents DNA replication stress, DNA damage and in cancer
15:40	Coffee break/waffles
16:10	Thomas Helleday
	Targeting DNA repair for cancer treatment: from PARP to MTH1 inhibitors
16:35	Ketan J Patel
	Why mammals require DNA crosslink repair
17:00	Peter Karran
	Protein oxidation and human DNA repair
17:25	Alan Tomkinson
	Targeting cancer cell mitochondria
17:50	Posters and refreshments
19:30	Dinner
Friday, June 19th 2015
07:30	Breakfast
Session V: DNA strand breaks and human disease
	Chair: Stephen West
09:00	Stephen West
	Mechanism of Holliday junction resolution by GEN1
09:25	Keith Caldecott
	DNA Strand Break Repair and Human Genetic Disease
09:50	Steve Jackson
	DNA double-strand break repair: a 20/20 vision
10:15	Valentyn Oksenych
	Deficiency of Ku70 rescues early postnatal lethality of XLF/DNA-PKcs double deficient mice
10:30	HaiLin Wang
	ATPase activity-regulated and unbound nucleotide sites-predominated RecA nucleofilaments are the active form for accurate homology recombination
10:45	Coffee
Session VI: The transcription machinery
	Chair: Jean Marc Egly
11:00	Jean Marc Egly
	Involvement of NER factors in transcription
11:25	Moshe Yaniv
	Chromatin remodeling: from transcription to cancer
11:50	Philip Hanawalt
	Consequences of arrested transcription - the good, the bad and the ugly
12:15	Jesper Svejstrup
	The transcription-related DNA damage response
12:40	Joanna Timmins
	Structural and functional studies of NER and HR processes in the extreme-radiation resistant bacterium D. radiodurans
13:00	Lunch
	Afternoon/evening free for sightseeing
Saturday, June 20th 2015
07:30	Breakfast
Session VII: DNA repair and the cell cycle
	Chair: Jiri Bartek
09:00	Jiri Bartek
	DNA damage signalling: Mechanistic insights and relevance for cancer
09:25	Ian D. Hickson
	How unfinished business from S-phase affects mitosis
09:50	Marco Foiani
	Mechanisms controlling the integrity of replicating chromosomes
10:15	Xinzhi (Xavier) Xu
	Regulation of CLASPIN-mediated CHK1 activation
10:40	Fabrizio d'Adda di Fagagna
	The role of RNA in the DNA damage response
11:05	Coffee
Session VIII: Mismatch repair
	Chair: Josef Jiricny
11:25	Josef Jiricny
	Multifaceted mismatch repair
11:50	Margherita Bignami
	Role of MUTYH in human cancer
12:15	Bruce Demple
	When DNA repair goes wrong: Formation and resolution of BER-generated protein-DNA crosslinks with oxidative lesion
12:30	Bernd Kaina
	DNA repair and ROS sensitivity of monocytes, macrophages and other immunocompetent cells
12:45	Manju Hingorani
	A dynamic process of mismatch recognition leads to a stalled MutS-MutL complex for initiation of DNA repair
13:00	Lunch
Session IX: Base excision repair (et al)
	Chair: Primo Schär
14:00	Primo Schär
	Active DNA demethylation by DNA repair - What is it good for?
14:25	Grigory Dianov
	DNA base excision repair
14:55	Geir Slupphaug
	Novel aspects of genomic uracil induction and processing
15:20	Coffee
15:40	Cristina Rada
	Uracil excision in the immune response
16:05	Eric Gilson
	How telomeres exert their influence genome-wide
Session X: EMBO editor
	Chair: Arne Klungland
16:30	Bernd Pulverer
	Transparent Publishing: How to Share Reproducible Data
17:20	Break
18:45	Champagne
Session XI: Tomas Lindahl
19:00	Tomas Lindahl
	Instability, decay and repair of DNA
20:00	Gala dinner
Sunday, June 21th 2015
07:30	Breakfast and departure